我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现一条EST序列,在NCBI的GenBank数据库中进行比对,结果发现该序列与其他物种的真核细胞翻译起始因子4E基因具有较高的相似性,推测可能是编码家蚕eIF4E蛋白的基因。然后通过RT-PCR技术从家蚕蛹中获得该基因的全长序列,并将该基因命名为.BmelF4E(Bombyx mori eukaryotic translationinitiation factor4E)基因,GenBank登录号为DN443192。生物信息学分析表明,该序列全长1445bp,包含633bp组成的ORF框,编码210个氨基酸残基,等电点为5.97,预测分子量为24.44kD,并含有一个IF4E超家族保守结构域。同源性比较结果表明该基因编码蛋白质的氨基酸序列与草地夜蛾(AF281654)的同源性达到91％。　　 为研究23meIF4E的功能,将该基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET-28a(+)-IBmeIF4E,转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),筛选阳性克隆,重组菌经IPTG诱导后菌体裂解物利用SDS-PAGE检测,与阴性对照相比在28kD处有一特异性条带。由于表达的融合蛋白既存在于上清中,也存在于沉淀中,因此利用菌体超声破碎后的上清直接利用镍亲和柱纯化融合蛋白。经FPLC反相柱层析进一步纯化后,进行质谱分析,结果显示该融合蛋白的分子量为27.87kD,与理论值28kD(融合标签3.56kD,BmeIF4E24.44kD)基本相符。以纯化所得蛋白为抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测该抗体血清的效价大于1:12800。　　 同时,利用荧光定量PCR和Western blot的方法分析了不同发育时期及五龄幼虫各组织中BmeIF4E基因的表达差异,定量内参选用β-actin,结果显示在卵、五龄幼虫、蛹和蛾四个发育时期中,蛾中的表达量最高,其次是蛹,再次是五龄幼虫,而在卵中表达量很少;各组织中BmeIF4E表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺。以上研究结果表明,BmeIF4E作为一种重要的管家基因,在家蚕的整个生命周期中均起着非常重要的作用。家蚕Bm5细胞中进行亚细胞定位研究结果表明BmeIF4E既存在于细胞质中也存在于细胞核中。　　 此外,以BmeIF4E基因的ORF为模板体外转录合成dsRNA,脂质体包埋转染Bm5细胞,72h后提取细胞总蛋白做Western blot检测RNAi情况,发现干扰后细胞总蛋白中BmeIF4E蛋白含量明显低于阴性对照组。MTT法检测结果表明,干扰后细胞活力也明显下降。