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本文利用海洋性微生物发酵褐藻胶制备褐藻胶寡糖。对发酵培养基组分及发酵条件进行了优化,并确定了在发酵罐发酵阶段控制pH为恒定值能获得更高的产物浓度。将发酵扩大到5L和50 L,通过产物及菌体浓度变化比较摇瓶发酵与两种发酵罐发酵效果。获得了该菌株发酵有价值的信息,为今后进一步开展该菌株的发酵奠定了理论基础。在此基础上提取了发酵液中酶,并进行了初步的分离纯化。
1.发酵条件优化
通过单因子试验和正交试验,在摇瓶发酵阶段对菌株的碳源、氮源、盐度、无机盐、pH、接种量等发酵条件进行了优化,得到了发酵最佳培养基成本和最适发酵条件。培养基组成:碳源褐藻酸钠6 g/L、氮源(NH4)2SO47g/L、无机盐K2HPO47 g/L、NaCl25 g/L、葡萄糖0-1 g/L、硫酸亚铁0.1 g/L;培养条件:起始pH值7.4、接种量15%、培养时间24 h、摇瓶转速180 rpm、装液量20 mL/50 mL。
2.种子菌的逐级别放大培养
按照种子菌生长的曲线绘制标准曲线,按照标准曲线上对应的最大菌体浓度及吸光值时刻接种,结果显示菌株在发酵罐和摇瓶培养的生长曲线前两个周期基本相同,在发酵罐中(18-24 h)菌株生长稳定期不如摇瓶(18-27 h)培养维持时间长。
3.发酵罐发酵褐藻胶
将发酵放大到5L和50 L,扩大规模后,培养液将变得越来越不均匀。对于大型发酵罐,在反应器的某些局部区域内氧处于耗竭状态。为避免此影响,5L发酵罐通气量为2.5(V/V-min),搅拌速度为220rpm;50L发酵罐通气量为40(V/V·min),搅拌速度为250 rpm,其他条件同摇瓶发酵。比较三种发酵情况下发酵液中菌体及产物浓度变化,发现不同情况下两者变化情况基本相同,发酵罐越大,其菌体浓度最大值相对高。对于50L发酵罐而言,菌体对数期相对其他两种发酵提前,产物浓度增加比较快,但是达到最大浓度相对滞后,相对于5L发酵罐和摇瓶发酵推迟了6h。最终结果标明发酵罐发酵都达到了较高的产物浓度和菌体浓度。
3.粗酶提纯及相对分子量测定
从发酵液中提取褐藻胶裂解酶,经硫酸铵初步盐析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换和Sephardex G-100分子筛层析,获得SDS-PAGE为单一蛋白纯的酶液,最高纯化倍数为5.99,比活力为136.23 U/mg,测定褐藻胶裂解酶的分子量约为40kD。