研究背景动脉粥样硬化是许多心血管疾病,脑血管疾病和外周血管疾病的共同病理学基础。血脂异常和脂质沉积是动脉粥样硬化发生和发展的关键步骤,血脂的升高在动脉粥样硬化的早期阶段发挥了重要的作用,血脂被认为是动脉粥样硬化的潜在诱因。大量研究表明,血脂异常可导致血液粘度增高、微循环障碍及内皮功能损伤。因此,降低血脂水平和血黏度,改善微循环成为治疗动脉粥样硬化斑块的一个治疗靶点。马黛是来源于南美巴拉圭冬青树上的叶子,药理研究表明,马黛具有减肥、降糖、降血压、抗氧化、抗炎、降脂等作用。前期工作证实, 马黛水提液可以降低高脂血动物模型的血脂水平,但相关临床试验尚未进行。课题组将进一步通过实验观察马黛对血脂、血黏度、微循环的影响。目的观察马黛对血脂升高人群的血脂水平、血黏度、微循环等相关指标的影响。方法1.研究对象及方法从2012年11月～2013年12月在山东中西医结合医院体检人群中筛选LDL-C、TC指标升高,且甲襞微循环图形异常的志愿者进行研究。142位高血脂患者按照1：1的比例随机分为马黛组和安慰剂组。经过六周的干预治疗,比较服用马黛及安慰剂治疗前后的各项检测指标。2.血液标本的采集分别于实验前后抽取空腹静脉血14毫升,8毫升做血液流变和血脂四项检查。其它血液样本以4000r/min离心6分钟,分离血清,立即冷却到-20℃冰箱内30分钟,-80℃冰箱储存。3.血脂检测志愿者早晨空腹采集静脉血,送至山东中西医结合医院体检中心检测,观察实验前后两组TC.HDL-C、LDL-C、TG等指标。4.甲襞微循环检测志愿者在23℃至25℃的室内休息15分钟。将香柏油均匀抹在被测者右手无名指指甲接缝处,让指甲接缝处位于显微镜光源正下方,通过XW880型彩色末梢血管观察仪检测甲襞微循环,对甲襞微循环的图像进行采集,通过甲襞微循环图像处理系统对图像的微循环各项参数进行计算分析。5.血液流变学检测采血20分钟至4小时内,用MEN-C100全自动血液流变动态分析仪检测志愿者血流变指标。6.血清6-keto-PGF1α和TXB2的检测6-keto-PGF1α和TXB2水平采用ABC-ELISA法检测。7.统计学分析所有试验数据采用SPSS19.0统计软件包进行统计分析。两组间比较采用pairedt-test检验；多组间比较采用LSD分析。P<0.05认为统计有显著差异。结果1.血脂结果分析经过六周的马黛及安慰剂干预,治疗后马黛组的HDL-C水平比治疗前升高,而TC、LDL-C、TG水平比治疗前下降,安慰剂组血脂水平没有显著变化。马黛组血脂水平接近正常健康对照组。2.甲襞微循环结果分析经过六周的马黛及安慰剂干预,治疗后马黛组的甲襞微循环的输入枝管径、输出枝管径、输出/输入枝管径、袢顶直径以及甲襞微循环形态积分比治疗前显著的下降,微循环血液流速比治疗前显著升高。在治疗后,马黛组微循环各项指标接近于正常健康人群。而安慰剂组微循环指标治疗前后没有显著变化。3.血流变结果分析经过干预, 治疗后马黛组的全血高切粘度、全血中切粘度、全血低切粘度、血浆粘度、血沉方程K值比治疗前显著下降。安慰剂组治疗前后没有显著变化。对血流变指标没有显著疗效。在治疗后,马黛组微循环各项指标接近于正常健康人群。4.血清TXB2、6-keto-PGF1α结果分析经过干预,治疗后马黛组的TXB2比治疗前显著下降,6-keto-PGFla水平显著上升,接近健康人群。治疗后安慰剂组的TXB2、6-keto-PGF1α与治疗前没有变化。结论1.马黛可以调节血脂异常人群的血脂水平,显著降低的TC、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平。2.马黛能够调节血脂异常人群的甲襞微循环、血流变及TXB2、6-keto-PGF1α等各项指标。3.临床研究证实每天服用马黛能使高血脂、高黏血症、血流异常的患者恢复正常,从而降低AS发生的危险。研究背景巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化早期病变的核心。氧化低密度脂蛋白通过诱导内皮下单核源性巨噬细胞泡沫化,产生动脉粥样硬化早期病变。在早期泡沫细胞形成过程中,巨噬细胞表面的清道夫受体特异性地结合OX-LDL,无限制地摄取OX-LDL,导致细胞胆固醇及胆固醇酯过度聚集而转化成泡沫细胞,形成脂质条纹。在此过程中,脂质代谢与炎症反应发挥极其重要的作用。炎症促进脂质沉积, 脂质又可增强炎症反应。一方面,OX-LDL促进炎症细胞浸润、激活并释放多种炎症因子；另一方面,激活的巨噬细胞吞噬、降解OX-LDL,导致细胞内胆固醇蓄积,形成泡沫细胞,促进炎症因子释放,而多种炎症因子的释放又加速细胞内胆固醇蓄积。虽然以前临床研究证明马黛可以降低血脂异常亚健康人群的血脂水平,但对动脉粥样硬化泡沫细胞的作用尚未证实。针对这一问题,我们设计了马黛抑制巨噬细胞源性泡沫细胞形成的细胞实验。细胞实验分为两个部分,第一部分是对马黛多酚在泡沫细胞的脂质蓄积和炎症反应的作用机制进行观察。第二部分是针对马黛多酚主要干预的清道夫受体LOX-1,构建基因慢病毒干扰载体,探讨马黛多酚与LOX-1基因慢病毒干扰载体对泡沫细胞脂质代谢和炎症因子的影响。第一部分 马黛多酚对泡沫细胞的脂质蓄积和炎性因子的影响目的观察马黛多酚对动脉粥样硬化巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中的内皮损伤、炎症反应、血脂代谢的作用。方法1.马黛多酚的制备：取马黛1000g,用70%乙醇,以10倍料液比,在80℃下回流提取60min,减压浓缩回收乙醇,得到浸膏。用蒸馏水将浸膏溶解,过AB-8型大孔树脂柱,真空浓缩,得到马黛总多酚25.3g。2.泡沫细胞的培养100 nmol/L的佛玻酯(PMA)加入到人的THP-1细胞培养基中,诱导48h形成巨噬细胞。50ug/ml的OX-LDL刺激24h巨噬细胞形成泡沫细胞。油红0染色观察泡沫细胞的脂滴情况。3.实验分组实验分为五组,即OX-LDL组、OX-LDL+辛伐他汀、OX-LDL+MP氐剂量、OX-LDL+MP中剂量、OX-LDL+MP高剂量。4.用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)检测各实验组LOX-1mRNA、ACATl mRNA、 PCSK9 mRNA、CD36 mRNA、SR-A mRNA的表达5. ELISA法检测各实验组各组细胞TC、FC、CE、TNF-α、IL-6、IL-1β、VCAM1表达水平6. Western blot检测各实验组LOX-1、AKT、NF-κB、ERK1/2的蛋白质表达及磷酸化改变7.统计学处理各组细胞均设3个样品进行干预,应用SPSS19.0统计软件包进行分析,多组间比较采用LSD分析。双侧P<0.05认为有显著差异。结果1.THP-1单核巨噬细胞泡沫化模型的建立以OX-LDL50ug/ml诱导巨噬细胞,经24h后,油红0染色。细胞浆内有大量红染脂质小滴,细胞内脂质含量大部分超过80%,泡沫细胞造模成功。2.各实验组细胞泡沫化的干预泡沫细胞分别经辛伐他汀和MP干预处理24h后,测量细胞内胆固醇、游离胆固醇、胆固醇脂含量,与模型组相比较, MP和辛伐他汀组细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇脂明显减少,说明MP和辛伐他汀均具有抑制细胞泡沫化的作用。3.MP对清道夫受体的作用经PMA和OX-LDL刺激巨噬细胞分化为巨噬泡沫细胞后,通过辛伐他汀与MP干预细胞,以Real-time PCR法检测测定细胞表面CD36、SR-A、LOX-1的表达。结果表明经辛伐他汀干预后,CD36、SR-A,LOX-1均显著降低。而不同浓度的MP处理后,只有LOX-1显著下降(P<0.01)。CD36、SR-A虽然也有轻微的下降,但没有统计学差异(P>0.05)。4.MP对炎症因子及黏附因子的作用通过ELISA检测各细胞实验组的TNF-α、IL-6、L-1β、VCAM1,结果显示辛伐他汀和MP干预可以显著降低TNF-α、IL-6、L-1β、VCAM1水平5.MP对AKT、NF-kb、ERK1/2蛋白表达的影响通过western blot检测各细胞实验组的AKT、NF-kb、ERK1/2的蛋白表达,结果显示辛伐他汀和MP干预可以显著降低PAKT/AKT、PNF-kb/NF-kb、 PERK1/2/NF-kb的比值。6.MP对ACAT1的作用通过Real-time PCR法检测各细胞实验组的ACAT1,结果显示辛伐他汀和MP干预可以显著降低细胞内ACAT1水平结论1.不同浓度的马黛多酚可抑制MFC形成。减少细胞内脂质的聚集,降低细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇脂的含量,降低CE/TC比值。2.马黛多酚对清道夫受体、炎性因子、黏附分子和脂质代谢均有调节作用。本部分的细胞实验证明,马黛多酚能降低清道夫受体LOX-1,炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β,黏附分子VCAM-1和脂质代谢关键基因ACAT1的表达,但对CD36、SR-A清道夫受体及PCSK9基因调节作用不明显。3.马黛多酚可调节ERK1/2、AKT、NF-KB等信号通路,通过减少细胞内脂质蓄积和炎症反应达到抑制泡沫细胞形成。第二部分构建LOX-1基因慢病毒干扰载体探讨MP对泡沫细胞脂质代谢和炎症因子的影响目的构建LOX-1基因的RNA干扰慢病毒载体,筛选最佳沉默点包装病毒。研究LOX-1基因沉默表达后对OX-LDL诱导泡沫细胞的脂质代谢及炎症相关基因的影响。方法1.LOX-1基因慢病毒干扰载体构建针对LOX-1基因(0LR1)设计并合成3条siRNA干扰靶序列,将合成好的单链DNA退火形成双链DNA,与双酶切的线性慢病毒载体连接得到重组载体,并与包装辅助质粒共转染293T细胞获得慢病毒颗粒。Western blot检测293T细胞LOX-1蛋白表达,筛选最佳干扰靶序列。2.实验分组泡沫细胞分为5组：空载体组、辛伐他汀组、200ug/ml MP组、LOX-1干扰组、200ug/ml MP+ LOX-1干扰组3. ELISA检测LOX-1慢病毒干扰后OX-LDL诱导泡沫细胞的TNF-α、IL-6、VCAM-1、 ICAM-1、MCP-1、eNOS、ACAT表达水平4. Western blot检测LOX-1慢病毒干扰后OX-LDL诱导泡沫细胞的哟X-1蛋白质表达及NF-κB的蛋白质表达及磷酸化改变5.统计学处理各组细胞均设3个样品进行干预,应用SPSS19.0统计软件包(IBM, Chicago,USA)进行分析,多组间比较采用LSD分析。双侧P<0.05认为有显著差异。结果1.LOX-1基因慢病毒干扰载体构建测序证实,靶向LOX-1RNAi慢病毒载体构建成功,Western Blotting结果3个RNAi组的LOX-1蛋白相对表达量较空白对照组与阴性对照组明显降低,其中LOX-1干扰位点2抑制效果最佳2.LOX-1慢病毒干扰载体在诱导泡沫细胞过程中对NF-kb的影响通过Western blot实验结果表明LOX-1基因沉默可导致NF-kb的活化,而联合MP干预则能促进NF-kb的活化。3.LOX-1慢病毒干扰载体在诱导泡沫细胞过程中对TNF-α、VCAM-1、MCP-1、 eNOS、ACAT表达水平结果ELISA结果显示LOX-1基因慢病毒干扰载体可显著降低TNF-α、VCAM-1、MCP-1、ACAT的表达,升高eNOS的表达。而联合MP干预则能促进这一效应。结论1.本研究运用RNAi技术成功构建靶向LOX-1RNAi慢病毒载体,并有效抑制LOX-1表达。2.LOX-1基因干扰可显著降低了细胞的TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、 ACAT1水平,升高了eNOS的水平,联合马黛多酚干预能增强这一效应,阻止泡沫细胞的形成。3.LOX-1基因沉默可抑制NF-κB信号通路的激活,从而降低炎症因子、黏附分子和细胞内脂质聚集。马黛多酚可以通过干预LOX-1/NF-κB信号通路,而发挥抑制巨噬细胞泡沫化、抗AS的作用。研究背景巨噬细胞源性泡沫细胞是以脂质代谢紊乱为基础的动脉粥样硬化的早期病理变化,泡沫细胞与血脂沉积、单核细胞聚集、血管内皮损伤、细胞内外脂质积聚、泡沫细胞形成和平滑肌细胞增生密切相关,其最终可以发展为脂质条纹和动脉粥样硬化斑块。因此,泡沫细胞在动脉粥样硬化斑块形成和发展过程中具有重要作用。在论文工我们前期的临床研究证明马黛可以降低血脂升高的亚健康人群血脂水平。在论文Ⅱ我们观察马黛多酚对清道夫受体、炎症因子、黏附因子、趋化因子的表达及细胞内脂质含量和蓄积的作用。因MP干预的主要清道夫受体是LOX-1,因此,我们检测LOX-1基因慢病毒干扰载体对泡沫细胞脂质蓄积及炎症反应的作用,马黛多酚具有加强LOX-1基因沉默的调控作用。虽然以往的研究表明,马黛多酚可以抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,但马黛多酚对动脉粥样硬化斑块的影响尚未得到证实,且关于马黛多酚与动脉粥样硬化斑块的关系未见报道。针对以上问题,我们设计动物实验探讨马黛抑制ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的形成及作用机制。我们的研究结果为揭示马黛在动脉粥样硬化治疗中的潜在作用机制提供了新的见解和应用价值。目的观察马黛多酚对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块内脂质代谢和炎症反应的作用,探讨马黛多酚抗动脉粥样硬化的部分作用机制。方法1.实验动物6周龄雄性apoE基因敲除小鼠60只给予高脂饲料喂养(含0.15%胆固醇+21%脂肪)。同种属C57BL/6J小鼠12只给予普通饲料喂养。12周后,将apoE基因敲除小鼠随机分为模型组、辛伐他汀组、MP小剂量组((50 mg/kg))、MP中剂量组((100mg/kg))、MP高剂量组((200mg/kg)),每组12只。C57小鼠为正常对照组,共6组。各组给予辛伐他汀或MP灌胃,每日一次,共12周。模型组和正常对照组小鼠同一时间给予相同剂量的水灌胃。2.取血在研究结束时,禁食12h,用过量戊巴比妥钠腹腔注射使小鼠安乐死后,眼球取血0.8m1,全血3000rpm离心l0min,取血清冷冻备用。用自动生化分析仪测定血脂,ELISA测定血液中其它指标。3.组织形态学分析：在实验结束时,剥离主动脉根部,制作成标本,进行HE染色或油红0进行观察4.血脂水平评估小鼠空腹血液样本直接送到山东省中西医结合医院医院体检中心,观察各组样本的TC,HDL-C,LDL-C和TG水平。5.ELISA法检测各实验组主动脉TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、eNOS、 ACAT的表达水平6.Western blot检测各实验组主动脉LOX-1、NF-κB的蛋白表达及磷酸化改变7.统计学处理应用SPSS19.0统计软件包进行分析,多组间比较采用LSD分析。双侧P<0.05认为有显著差异。结果1.病理形态检测结果MP干预12周后,HE染色观察主动脉结构显示正常对照组、辛伐他汀组、MP高剂量组内膜结构正常,没有脂质沉积。其余各组可见AS脂质斑块的形成,管腔有不同程度的狭窄。与模型组相比较,各治疗组随着MP浓度的升高,斑块内脂质侵润逐渐降低。2.对血脂水平分析模型组血液中的TC,TG和LDL-C浓度明显高于正常组。与模型组比较,各治疗组TC,TG和LDL-C水平均显著降低。因此,MP可以通过降低TC、TG、LDL-C水平调节脂质代谢3.对炎症反应分析采用ELISA法检测各组动脉板块的TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1水平,western blot法检测NF-κB的水平。结果表明,MP通过干预NF-κB、TNF-α、 IL-6、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的水平,抑制炎症反应。4.对血管内皮细胞分析的保护作用ELISA结果显示MP可以通过提高eNOS水平,达到保护动脉血管内皮的作用。5.对ACAT1水平的分析通过ELISA法检测各组ACAT1水平,结果表明,辛伐他汀和MP干预各组动物,可降低斑块内ACAT1的水平。结论1.马黛多酚降低ApoE基因敲除小鼠血液中TC、TG、LDL-C,下调LOX-1和ACAT-1表达,显著地抑制OX-LDL诱导巨噬细胞源性泡沫细胞形成和AS斑块的形成。马黛多酚调节脂质代谢的作用是其抗动脉粥样硬化的作用机制之一。2.马黛多酚通过抑制NF-KB信号通路的活性,降低ApoE基因敲除小鼠斑块内的TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1等炎性因子、粘附分子、趋化因子水平,MP对炎症反应的调节作用是其抑制泡沫细胞的形成、抗动脉粥样硬化的另一个重要的作用机制。3.马黛多酚可以抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变进展,其可能的机制与调节脂质代谢和抑制炎症反应相关。MP可作为抗动脉粥样硬化治疗药物发展的一种潜在的饮食。