木质纤维为全球最大的可再生资源,主要由纤维素(占35-50%)、半纤维素(占25-35%)和木质素(占15-40%)等三大组分构成。理论上,可将其中的纤维素水解为葡萄糖,半纤维素水解为戊糖或己糖,再通过微生物发酵生产乙醇产品,解决整个乙醇发酵产业,包括传统的酒精制造业和新兴的生物燃料乙醇产业,长期面临的原材料供应不足,难以持续保障的技术难题,具有重要意义。目前,国内外实现木质纤维乙醇商业化工业生产主要面临三大技术瓶颈：(1)木质纤维原料的低成本组分分离和纤维素的水解糖化；(2)纤维素水解糖液的高浓度乙醇发酵；(3)半纤维素水解产物戊糖的高效转化乙醇。本文针对这些技术瓶颈,开展了木质纤维超高压爆破预处理及乙醇发酵研究,内容包括木质纤维超高压爆破预处理及酶解糖化、纤维素水解糖液高浓度乙醇发酵酿酒酵母菌株的选育、酿酒酵母乙醇发酵高产菌株的生产试验和酿酒酵母乙醇发酵基因组比较分析等四个部分。1.木质纤维超高压爆破预处理及酶解糖化研究本文在国际上首创开展了木质纤维的超高压爆破预处理研究。将蔗渣粉碎至40目,用0.2%的NaOH于100℃蒸煮l0min,并加入0.2%的黄原胶使之颗粒保持悬浮状态,再通过高压均质设备,实现了超高压爆破处理,爆破压力最高达100MPa。鉴于高压均质的处理过程与蒸汽爆破、氨爆、CO2爆破等极为相似,即先对物料施以一个极高的压力,然后将压力瞬时释放,达到对物料进行爆破的目的,所不同的是处理压力为液压,而且压力极高,将该处理方法命名为超高压爆破(Ultra-high pressure explosion,UHPE)预处理法。蔗渣、稻草、柳枝稷等木质纤维经UHPE处理后,浅黄色的颗粒悬浮液被转变为棕褐色的粘稠流体,即物料被流体化。扫描电镜观察结果显示,其超微结构受到显著破坏,由原来坚实的纤维状结构,转变为疏松的“中空”多孔结构。粒度测定结果显示,UHPE使蔗渣颗粒微小化。100MPa的UHPE处理后,蔗渣平均粒度由约600um降低为65.0βum,降低了89.15%,爆破压力与蔗渣粒度的倒数具有线性关系,相关系数具有统计学显著意义(P<0.01)。X-射线衍射测定结果显示,蔗渣的结晶指数(CrI)随爆破压力的上升而降低。100MPa的UHPE处理后,其CrI由54.83%降低至45.34%,降低了17.31%。采用来自绿色木霉的纤维素水解酶对UHPE处理前后的蔗渣进行酶解,酶解率随爆破压力的增加逐步提高,爆破压力与酶解率具有线性关系,相关系数具有统计学显著意义(P<0.01)。在酶添加量为每g干样品5.8FPU的纤维素酶,6.6IU的木聚糖酶和0.5CBU的β-葡萄糖苷酶的条件下,100MPa的UHPE处理使蔗渣酶解72h的酶解率达到了59.43%,较只做0.2%的NaOH,100℃蒸煮10min,未经爆破处理的样品提高了101.18%,较不经任何处理的对照样品提高了389.14%。UHPE处理后将物料固液分离,分别测定其主要化学成。随爆破压力的提高,蔗渣固相样品的还原糖含量逐步增加,Klason木质素、酸溶性木质素等成分的含量逐步减少。100MPa爆破处理后,还原糖含量由原73.67%,增加为78.93%,增加了7.14%,Klason木质素和酸溶性木质素分别由14.64%和7.74%降低为12.30%和6.87%,分别降低了15.98%和2.78%。不同压力UHPE处理的还原糖回收率最高为98.38%,最低为97.20%。表明超高压爆破处理对蔗渣的主要组分几乎没有影响。进一步提高碱蒸煮强度,用0.5～1.0%的NaOH,125℃下将木质纤维蒸煮120min,然后对物料进行100MPa的UHPE处理,研究UHPE与稀碱联合预处理对木质纤维酶解糖化的影响。结果显示,UHPE处理后,蔗渣、稻草、柳枝稷等木质纤维对NaOH的消耗量分别被提高了30.66%、163.41%和53.94%。UHPE与稀碱蒸煮联合处理后,蔗渣、稻草和柳枝稷等样品的还原糖含量分别由73.67%、51.00%和59.01%提高至90.60%、91.16%和89.49%,分别提高了22.98%、78.75%和51.65%。Klason木质素含量分别由14.64%、26.10%和18.70%降低为5.78%,4.69%,和4.15%,分别降低了60.52%、82.03%和77.81%；酸溶性木质素含量分别由7.74%、10.23%和13.03%降低为6.70%,6.02%和5.99%,分别降低了13.44%、41.15%和54.03%。蔗渣的总还原糖回收率达到了96.97%,表示超高压爆破与稀碱联合预处理对木质纤维的主要成分也基本没有影响。UHPE与稀碱联合预处理后,在纤维素酶添加量同样为每g干样品5.8FPU的纤维素酶,6.6IU的木聚糖酶和0.5CBU的β-葡萄糖苷酶的条件下,蔗渣酶解36h、48h、60h和72h的酶解率分别达到了90.03%、90.48%、94.50%和95.53%,酶解72h的酶解率较未经任何处理的对照样品(12.15%)提高了6.86倍(686.26%)。稻草酶解48h、60h和72h的酶解率分别达到了90.53%、95.98%和100.09%,酶解72h的酶解率较未经任何处理的对照样品提高了2.03倍(202.66%)。柳枝稷酶解48h的酶解率达到最大,为97.60%。较未经任何处理的对照样品(23.53%)提高了3.15倍(314.79%)。采用朗缪尔等温方程(Langmuir isotherm equation)测定蔗渣可及面积(Accessible surface area,ASA)的结果显示,随UHPE处理压力的提高,蔗渣对纤维素酶的吸附逐渐增加,即可及面积逐步增大。最大吸附量与酶解率,以及爆破压力与纤维素酶的最大吸附量均具有线性关系,相关系数均具有统计学显著意义(P<0.001)。综合上述结果显示,UHPE为一种能够显著破坏木质纤维的超微结构,改变木质纤维物料特性的预处理方法。该法通过破坏木质纤维的超微结构,增大纤维素酶的作用面积来显著提高酶解效果。由于具有处理成本较低,处理条件比较温和,处理后纤维素的酶解率达到95%以上,UHPE与稀碱联合处理工艺具有较好的工业应用前景。2.纤维素水解糖液高浓度乙醇发酵酿酒酵母菌株的选育研究根据纤维素水解糖液高浓度乙醇发酵对菌株的要求,从陈年甘蔗糖蜜筛选得到了三株酿酒酵母乙醇发酵高产菌株,经rDNA ITS序列同源比对鉴定均属酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的不同菌株,命名为MF1001、MF1002和MF1003。通过对三菌株的碳源同化能力、对糖分的利用能力、在甘蔗糖蜜中的生长情况、乙醇发酵能力等进行比较,选取乙醇发酵综合性状最为优良的MF1001菌株作为纤维素水解糖液的乙醇发酵菌株,并对该菌株发酵纤维素水解糖液产乙醇的相关性状进行研究。MF1001乙醇发酵工艺条件的研究结果显示,菌株在20。Bx甘蔗糖蜜中生长和乙醇发酵均不受影响,在30。Bx糖蜜中生长和乙醇发酵被延迟8h,在40。Bx糖蜜中生长和乙醇发酵受严重抑制。菌株乙醇发酵的适宜温度为30℃,pH值4.0的发酵效果明显优于pH值3.8,传代培养16代及不同的接种量对菌株的乙醇发酵没有影响。按目前甘蔗糖蜜乙醇生产的发酵工艺,发酵50h的乙醇浓度达到了13.2%(V/V),60h达13.8%(V/V)72h达14.3%(V/V)。发酵结束时醪液的可发酵残糖含量降低至0.44%,发酵效率分别为理论值的88.6%(50h)94.3%(60h)和98.6%(72h)针对UHPE与稀碱联合预处理和酶解糖化所得的纤维素水解糖液的特性,进一步研究MF1001发酵纤维素水解糖液产乙醇的性能。结果显示,3600PPM(0.36%)的残留木质素对菌株的生长和乙醇发酵完全没有影响,7200PPM(0.72%)的残留木质素使菌株生长和乙醇发酵延迟8h,14400PPM(1.44%)的残留木质素使菌株的生长和乙醇发酵完全被抑制。将MF1001用于蔗渣纤维素水解糖液的乙醇发酵,发酵40h的乙醇浓度达到了7.2%(V/V),发酵效率达到了理论值的91.84%。将纤维素水解糖液与甘蔗糖蜜混合进行乙醇发酵,该菌株发酵48h的乙醇浓度达到了14.77%,较单纯甘蔗糖蜜乙醇发酵的浓度(13.02%±0.62%,V/V)高13.44%。表明MF1001完全适用于纤维素水解糖液高浓度乙醇发酵,具有高抗、高产、高效等优点,工业应用前景显著。3.酿酒酵母乙醇发酵高产菌株的生产试验为验证MF1001菌株在工业上应用的可行性,将该菌株用于年产5万吨规模的甘蔗糖蜜乙醇发酵生产,进行生产试验。生产工艺为双流加酸性连续发酵工艺。15d的试验结果表明,班产乙醇发酵浓度最高达到14.1%(V/V),日产平均浓度最高达13.8%(V/V),发酵醪液的可发酵残糖含量在0～0.7%的范围内波动,平均为0.25%,发酵效率按糖蜜可发酵糖含量计算最高达到理论值的98.89%,平均97.72%,生产吨乙醇(95%,W/V)的发酵废水排放量最低为7.75t,平均为8.17t,各项工艺指标均显著优于国内目前的生产水平。对试验期间的各工艺参数进行统计分析表明,1#发酵罐(生产菌种培养罐)的菌数、乙醇浓度和可发酵残糖含量与乙醇发酵浓度分别呈“钟形”曲线关系,负相关的线性关系和正相关线性关系,菌数为2.10～2.15×108/ml时发酵乙醇浓度最高,2#罐(发酵启动罐)可发酵残糖含量与乙醇发酵浓度具有正相关的线性关系,相关系数均具有统计学显著意义。生产试验结果证实MF1001完全可用于大规模工业生产。4.酿酒酵母乙醇发酵基因组学比较分析对三株来自同一陈年甘蔗糖蜜的高渗筛选环境,乙醇发酵性状不同的野生型酿酒酵母系列菌株MF1001、ME1313和MC1414进行乙醇发酵性状比较、全基因组重测序和比较基因组学分析。与低产菌株ME1313和MC1415相比,乙醇发酵高产菌株MF1001具有乙醇发酵浓度高,呼吸作用强,对甘蔗糖蜜高渗环境的耐受能力强,细胞在培养基的存活时间较长,而糖分利用能力相对较弱,碳源利用范围较窄,细胞生长速率相对较慢,不能利用麦芽糖等特点。对高、低产菌株的全基因组比较分析结果显示,高产菌株基因组的单核苷酸多态性(SNP)和基因组结构变异(SV)的数量及其异源突变程度均显著高于低产菌株。高产菌株MF1001的基因组含有59467个SNP和811个SV,其中,45.04%的SNP为异源SNP,同源SNP只占54.96%,71.89%的SV为插入性SV,缺失性SV仅占总SV的28.11%。而低产菌株ME1313和MC1415的基因组分别只含有39674个和42338个SNP,较高产菌株MF1001分别低32.7%和28.6%。其异源SNP分别只占1.57%(ME1313)和1.50%(MC1415),其余的全是同源SNP。低产菌株ME1313和MC1415的SV则分别只有556个和507个,分别较MF1001少31.44%和37.48%。而且,其插入性SV分别只有63.49%(ME1313)和50.3%(MC1415),也显著低于高产菌株。高、低产菌株基因组的片段插入缺失(InDel)数量差异不大,MF1001、ME1313、MC1415三菌株分别为2225个、2429个和2299个。但高产菌株InDel的异源突变程度显著高于低产菌株。高产菌株MF1001有23.06%的InDel为异源性质,低产菌株ME1313和MC1415的异源InDel分别只有5.31%和4.39%。同源基因突变分析结果表明,高产菌株突变同源基因的数量显著多于低产菌株,发生有义突变的比例也略高于低产菌株。高产菌株MF1001的基因组序列与低产菌株ME1313比对显示,发生突变的同源基因共4234个,其中,3155个为有义突变,占突变总数的74.52%,无义突变数为1079个,占总突变的25.48%,与低产菌株MC1415比对显示,突变同源基因为4223个,3253为有义突变,占总突变数的77.03%,无义突变为970个,只占总突变的22.97%；而二株低产菌株ME1313和MC1415的基因组序列相互比对显示,突变同源基因为3661个,其中,有义突变为2617个,占突变总数的71.48%,无义突变为1044个,占突变总数的39.89%。采用BWA在线分析软件,分析三菌株突变同源基因的分布情况。结果显示,基因功能群水平上,三菌株的分子功能(Molecular Function)和生物学过程(Biological process)二个功能群的突变同源基因的富集程度较高,富集区的基因突变率均显著高于全基因组的平均突变率,而细胞组分功能群(Cellular component)同源突变基因的富集程度相对略低。三菌株在演化过程中其同源基因突变的富集存在一定的规律性,与细胞结构(Cell)、细胞分区(Cell part)、细胞壁(Envelope)、转录调节因子活力(Transcription regulator activity)、分子传导体活力(Molecular transducer activity)、多细胞过程(Multicellular process)、生长(Growth)、色素形成(Pigmentation),以及应激反应(Response to stimulus)等相关的基因群为同源基因发生突变的主要富集区,与酶调节因子活力(Enzyme regulator activity)、转运体活力(Transporter activity)、定位(Localization)、定位建立(Establishment of localization)、细胞组分组织化(Cellular component organization)、发育过程(Developmental process)、细胞过程(Cellular process)和代谢过程(Metabolic process)等相关的基因群也有较高的突变同源基因富集,而与结构分子活力(Structure molecule activity)、电子载体活力(Electron carrier activity)、抗氧化物活力(Antioxidant activity)、翻译调控因子活力(Translation regulator activity)、金属伴侣活力(Metallochaperone activity)、繁殖(Reproduction)、解剖结构形成(Anatomic structure formation)、死亡(Death),以及细胞组分生物生成(Cellularcomponent biogenesis)等相关的基因群中同源基因的突变率较低。针对高、低产菌株乙醇发酵的性状差异,对三菌株的全基因组序列进行Blast比对(Nucleitide—Nucleitide BLAST)和基因功能分析,共识别出56个与酿酒酵母乙醇发酵相关的调控基因。其中,与细胞循环相关的调控基因43个,占76.8%,其余的为与糖代谢相关的基因。综合上述研究结果,本文认为,乙醇发酵高产菌株MF1001的基因突变主要来自异源基因或DNA片段的插入；短片段缺失(Indel)对酿酒酵母基因组功能突变的影响较SNP和基因组结构变异(SV)要弱；异源基因或DNA片段插入导致的SNP和基因组结构变异(SV)所引起的基因组功能变异可能是该菌株乙醇发酵相关性能发生突变的主要原因。在菌株的演化过程中,与基础代谢、细胞结构等相关的基因也发生显著突变,这意味酿酒酵的乙醇发酵不仅与代谢途径相关的基因有关,还可能受许多与细胞的基础代谢、细胞结构相关基因的调控。总之,本文在国际上首创开展了木质纤维超高压爆破预处理研究,研究建立了具有显著工业应用潜力的木质纤维超高压爆破与稀碱联合预处理技术,筛选得到了符合纤维素水解糖液乙醇发酵要求的高产、高抗、高效酿酒酵母乙醇发酵生产菌株MF1001,研究优化了该菌株的乙醇发酵工艺,通过生产试验证实了该菌株用于工业生产完全可行。最后,通过对来自相同筛选环境,乙醇发酵性状不同的三株酿酒酵母菌株MF1001、ME1313和MC1415进行全基因组测序和比较基因组学研究,显示了乙醇发酵高产菌株MF1001演化过程的基因突变规律,识别出56个与酿酒酵母乙醇发酵相关的调控基因。这些研究为木质纤维乙醇实现商业化工业生产提供了极有价值的物料预处理方法和乙醇高浓度发酵菌株,为酿酒酵母乙醇发酵的基因调控研究和高产菌株构建提供了理论和技术支撑,具有极为显著的应用和理论意义。