论文部分内容阅读
目的： 1.研究黄芪甲苷（astragnalosideⅣ，Ast IV）和环黄芪醇（cycloastragenol， CAG）对C2C12细胞和MC3T3-E1细胞骨形成的影响。 2.探讨H2O2引起氧化应激造成C2C12细胞和MC3T3-E1细胞的损伤和凋亡，比较Ast IV和CAG的干预效果。 3.复制H2O2引起氧化应激导致衰老的细胞模型，探讨CAG是否能够在骨形成相关细胞中激活端粒酶，并通过调控JAK2/STAT5b信号通路产生抗衰老的作用。 方法： 1.选取具有多分化潜能的细胞（C2C12细胞）和前成骨细胞(MC3T3-E1细胞）为实验对象，用Ast IV或CAG处理C2C12细胞或MC3T3-E1细胞，分别应用 MTT法、硝基苯二磷酸底物法和茜素红染色法检测C2C12细胞和MC3T3-E1细胞的增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及钙化结节面积，以观察Ast IV和CAG对C2C12和MC3T3-E1细胞增殖和骨形成能力的作用，并观察这种作用的时效和量效关系，从而筛选出Ast IV和CAG的有效浓度。 2.用H2O2诱导氧化应激模型，采用MTT法、硝基苯二磷酸底物法、茜素红染色法和酶联免疫吸附法分别检测在氧化应激状态下Ast IV和CAG对氧化应激诱导成骨的C2C12细胞和MC3T3-E1细胞损伤的保护作用，并且比较两种药物的干预效果。 3. DCFH-DA探针法检测Ast IV和CAG对细胞内活性氧水平的影响；应用Hoechst33258染色法和Annexin V/PI染色法观察Ast IV和CAG对氧化应激介导的细胞凋亡的保护作用；Western Blot法检测Ast IV和CAG对凋亡蛋白Bcl-2 和Bax表达的影响。 4.复制H2O2引起氧化应激导致衰老的细胞模型，用β-半乳糖苷酶染色法和细胞周期凋亡检测法验证衰老模型及观察Ast IV和CAG的干预作用；酶联免疫检测法检测与衰老相关的端粒酶的活性；Western Blot法检测与端粒酶有关的JAK2/STAT5b信号通路中相关蛋白的表达，并探讨CAG是否能够在骨形成相关细胞中激活端粒酶，从而通过JAK2/STAT5b信号通路的调控研究抗衰老的作用。 结果： 1.在体外培养细胞的实验中，以淫羊藿苷（Icariin，10μM）为阳性药物对照组，Ast IV的浓度范围1.25μM～20μM，CAG的浓度范围0.03μM～3μM。MTT结果显示，前述不同浓度的Ast IV和CAG均可不同程度的促进细胞的增殖， C2C12细胞和MC3T3-E1细胞分别处理72h和48h后增殖达到高峰，且与Icariin组相比，Ast IV和CAG促进细胞增殖的作用更加明显；选取Ast IV和CAG两种药物的有效浓度作用于给予诱导的C2C12细胞，结果表明，Ast IV（10μM）和CAG（0.3μM）均具有明显的促进碱性磷酸酶表达的作用且均在第5天作用达到高峰（P<0.05），且Ast IV组和CAG组相对于Icariin组效果不明显；Ast IV和CAG还能促进MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶的表达，且均在第7天达到高峰，其中Ast IV以10μM为最佳浓度（P<0.05），CAG以0.3μM为最佳浓度（P<0.05），且与Icariin组比较，CAG组效果更佳而Ast IV组的效果不明显。Ast IV和CAG作用于给予诱导的MC3T3-E1细胞50天后，茜素红染色结果显示，Ast IV（10μM）和CAG（0.3μM）处理组中矿化结节的数量和面积较单独诱导组均明显增多（P<0.05），且与Icariin组比较，CAG组效果更佳而Ast IV组的效果不明显。 2.用不同浓度的H2O2（50μM～250μM）处理C2C12细胞或MC3T3-E1细胞，结果表明，H2O2浓度为200μM且作用24h后，两种细胞出现氧化应激的效果最佳（P<0.05）。H2O2能够抑制细胞活力（P<0.05），引起细胞内碱性磷酸酶活性降低（P<0.05），减少矿化结节面积和骨钙素（OCN）表达水平（P<0.05）， Ast IV和CAG均能够明显地对抗这种作用。 3.应用DCFH-DA流式细胞技术检测结果表明，Ast IV和CAG可明显抑制H2O2导致的ROS升高现象（P<0.05）；采用Hoechst33258染色法和Annexin V/PI染色法结合Western Blot分析，H2O2组的凋亡细胞增多且凋亡蛋白Bcl-2表达减少及Bax蛋白表达增加明显，当用Ast IV和CAG干预后结果发现Ast IV和CAG能够显著减少H2O2导致的细胞凋亡（P<0.05）。 4.用β-半乳糖苷酶染色法和细胞周期凋亡检测法分析细胞衰老的研究结果表明，200μM的H2O2作用细胞24h可成功复制细胞衰老模型，并且Ast IV（10μM）和CAG（0.3μM）有明显的干预作用（P<0.05），CAG的效果最佳；酶联免疫检测法结合Western Blot法检测与衰老相关的小鼠（TE）端粒酶的活性以及与端粒酶相关的信号通路蛋白的表达。结果发现，H2O2降低细胞端粒酶的活性，抑制JAK2/STAT5b信号通路的相关蛋白hTERT、JAK2、STAT5b、P-STAT5b和Bcl-XL蛋白表达，同时，结果提示CAG可能通过激活端粒酶而调控该信号通路抵抗细胞衰老。 结论： 1. Ast IV和CAG可促进正常状态下C2C12细胞和MC3T3-E1细胞的增殖、成骨分化和矿化；也可对抗H2O2对C2C12细胞和MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化和矿化的抑制作用。 2. Ast IV和CAG可抑制氧化应激导致的C2C12细胞和MC3T3-E1细胞凋亡。 3. CAG在氧化应激状态下能够激活细胞内的端粒酶，从而抵抗细胞的衰老，其机制可能与JAK2/STAT5b信号通路有关。