抗核盘菌芽胞杆菌的筛选鉴定及抗菌物质研究

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核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种世界性分布的重要植物病原真菌,在我国严重威胁油菜生产。利用有益微生物控制核盘菌是目前菌核病防治研究的重点方向。本研究分离到一株对核盘菌有显著拮抗活性的芽胞杆菌X-01菌株,并对其分类地位进行了鉴定、对其拮抗物质进行了分离纯化、对其拮抗物质控制油菜菌核病生防效果进行了评估,结果如下:1.通过对峙培养法,从油菜根际土壤中筛选得到一株对核盘菌有良好拮抗效果的菌株X-01。同时采用形态学观察、生理生化分析、16S rDNA同源性与系统发育分析进行种属鉴定确认菌株X-01为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。2.枯草芽胞杆菌X-01发酵液经1 mg/mL的蛋白酶K、胰蛋白酶处理都未见抗菌活性的降低,而且经121℃处理30 min仍有50%的抗菌活性;枯草芽胞杆菌X-01的活性物质能穿过截留分子量为100 kDa的超滤膜,却被截留分子量为30 kDa的膜截留,但向发酵液中加入终浓度50%为甲醇后,活性物质能穿过截留分子量为30 kDa的超滤膜,推测枯草芽胞杆菌X-01所产的拮抗物质属于脂肽类抗生素。3.结合超滤、固相萃取、高效液相色谱对枯草芽胞杆菌X-01的抗菌活性物质进行了分离纯化。基质辅助激光诱导解吸附电离飞行时间质谱分析显示活性物质的分子量为1042.9 Da,用电喷雾电离并结合碰撞活化解离质谱技术进一步确定活性物质的一级结构为Pro-Asn-Ser-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln(βAA为14个碳原子的氨基脂肪酸),属脂肽类抗生素伊枯草菌素A2(iturin A2)。4.经离体叶片测试,枯草芽胞杆菌X-01抗菌活性物质浓度为100μg/mL时对油菜菌核病的防治效果达100%,10μg/mL时的防治效果仍有40.7%。5.通过显微观察,被枯草芽胞杆菌X-01抗菌活性物质作用后的核盘菌菌丝畸形,原生质凝结,细胞壁穿孔,致使胞内物外溢,菌体最后发生死亡。
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