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目的:课题组前期研究发现碱性成纤维细胞因子(Basic fibroblast growth factor,b FGF)可调控根尖牙乳头干细胞(Stem cells from the apical papilla,SCAP)成骨/成牙本质分化,维持SCAP分化潜能,Wnt/β-catenin信号通路和p38信号通路参与了该过程并存在相互串扰。本实验在前期研究基础上,通过转录组测序进一步分析b FGF在调控SCAP成骨分化中的分子机制,为SCAP的进一步研究和临床应用提供理论实验基础。方法:1、采用酶消化法获得人原代SCAP,通过有限稀释法、克隆化传代培养SCAP,免疫荧光染色检测间充质干细胞标志物,并通过成骨成脂分化诱导进行多向分化能力鉴定。2、将第三代SCAP细胞分为两组:实验组(20ng/m L b FGF+成骨诱导液),对照组(成骨诱导液),分别诱导7天和14天,每组3个生物学重复,收集各样本的总RNA。RNA质检、构建c DNA文库、Hi Seq测序,构建SCAP的转录组数据库。质检数据库、比对基因组、基因表达水平和差异表达分析,筛选差异表达基因。以差异表达基因为对象,进一步进行基因功能注释、信号通路富集及差异基因网络互作分析。3、将阈值设为p<0.05且|log2foldchange|≥1进行转录组测序结果分析,筛选出差异表达基因,并通过q RT-PCR进行验证。按前述分组,将SCAP在含b FGF和不含b FGF的成骨诱导液中分别培养7天和14天,每个样本有3个生物学重复,并收集各样本的总RNA,以β-actin为内参,检测差异表达基因(MMP13、MMP3、POSTN、FBN2、COL15A1)m RNA的相对丰度。结果:1、采用酶消化法获得原代SCAP细胞,显微镜下观察5天左右见呈集落生长的SCAP,细胞形态短梭形,胞浆丰富,10天左右细胞生长至80%左右,有限稀释法克隆培养的SCAP生长速度快、形态一致;免疫荧光染色结果示:CD24、波形丝抗体染色后细胞胞浆呈绿色,STRO-1抗体染色后细胞胞浆呈红色,角蛋白抗体染色胞浆无染色;胞核均为DAPI染色;细胞多向分化能力鉴定:SCAP经成骨成脂诱导28天后分别通过茜素红/油红O染色,可观察到有矿化结节/脂滴形成。2、提取12个样本的总RNA纯度高,质量较好。RNA-seq测序数据质量评估结果表明,12个样本共有57,6002,462条读段,碱基分布均匀,数据通过与参比基因组比对,每个样本的定位率>97%。3、差异基因表达分析结果显示,与对照组相比7天实验组共有451个基因显著表达(p<0.05且|log2foldchange|≥1),其中178个上调基因,273个下调基因;与对照组相比,14天实验组共有1298个显著表达基因,其中469个基因上调,829个基因下调。Venn分析表明,7天和14天两实验组共同上调基因86个,共同下调基因144个。通过对显著差异表达基因的分析发现,b FGF作用SCAP成骨分化可显著上调MMP13、MMP3、POSTN的基因表达水平,以及显著下调FBN2、COL15A1的基因表达水平。4、GO富集分析差异表达基因结果显示,7天和14天两实验组共同差异表达基因显著富集GO条目共50条(P<0.05),这些差异富集基因的功能主要涉及多细胞生物发展、细胞传导、细胞分化、细胞粘附、细胞外基质及积极调控细胞增殖等。KEGG分析结果显示,共同差异表达基因显著富集信号通路主要有ECM-受体相互作用(ECM-receptor interaction)、细胞因子-细胞因子与受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)及PI3K-AKT信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。5、通过7天和14天两实验组,共同差异表达基因互作网络分析,并根据节点的大小挑选出以下关键基因:PTGS2(COX2)、RSPO3、WNT2、BMP3、JAK3和BCL2A1(上调),FN1、DKK1、RSPO1及COL15A1(下调)等,而这些基因又与骨基质的形成、细胞矿化、WNT信号通路、ECM-受体相互作用、PI3K-AKT信号通路相关。6、q RT-PCR结果显示,实验组与对照组相比,MMP13、MMP3、POSTN的表达显著上调(p<0.05),而FBN2和COL15A1的表达显著下调(p<0.05),与RNA-seq检测结果一致,这些基因与胶原降解、骨矿化和细胞增殖相关。结论:Wnt信号通路、PI3K-AKT信号通路及ECM受体相互作用途径参与了b FGF调控SCAP成骨分化过程,b FGF通过促进SCAP细胞增殖,趋化和粘附,提高SCAP自我更新能力的同时抑制细胞凋亡和成骨分化能力,维持SCAP成骨分化潜能。