【摘 要】
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实验目的CD40配体(CD40L)又称CD154,是分子量约30~39kDa的Ⅱ型跨膜蛋白,主要表达于活化的CD4T细胞.CD40主要表达于成熟的B细胞,CD40L与之结合,为B细胞成熟、活化提供重要的辅
【出 处】
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中国协和医科大学 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部
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实验目的CD40配体(CD40L)又称CD154,是分子量约30~39kDa的Ⅱ型跨膜蛋白,主要表达于活化的CD4<+>T细胞.CD40主要表达于成熟的B细胞,CD40L与之结合,为B细胞成熟、活化提供重要的辅助信号,促进其生发中心形成、同种型转化和抗体产生.CD40L也能促进树突状细胞(DC)、巨嗜细胞、成熟B细胞等抗原呈递细胞(APC)的活化,上调细胞因子的分泌和共刺激分子CD80、CD86的表达,从而与表达CD28的T细胞结合,促进后者的增殖.由于其在免疫应答过程中的关键地位,CD40-CD40L已被应用于多种疾病的研究.目前CD40L在肿瘤免疫治疗研究的策略主要有两种:构建CD40L体系和基因治疗.将CD40L体系与CD40<+>肿瘤细胞共培养,可增强肿瘤细胞的免疫原性,再将肿瘤细胞回输体内.也可直接将CD40L输入体内,发挥抗肿瘤免疫效应.而CD40L基因治疗研究主要是将CD40L转染肿瘤细胞,使之成为基因工程肿瘤疫苗.这两种策略均已经从基础研究走入了临床试验,并显示出良好的应用前景.基于上述理论,我们对CD40L修饰的肿瘤疫苗进行了初步研究.实验方法从植物血凝素(PHA)活化的人外周血单个核细胞(PBMC)中,以RT-PCR法扩增人全长CD40L(hCD40L)基因.再将hCD40L克隆到质粒载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA-hCD40L.然后应用阳离子脂质体LIPOFECTAMINE 2000转染人慢性髓系白血病(CML)细胞系K562,转染后20小时添加Ca<2+>载体A23187.转染24小时后,通过流式细胞术检测CD40L的瞬时表达以及CD86等共刺激分子的表达.同时收集细胞培养上清,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IFN-γ的分泌.实验结论本重组质粒pcDNA-hCD40L能够转染表达于K562细胞系,并上调CD86的表达,诱导IFN-γ的分泌.联合应用Ca<2+>载体能增强CD40L和CD86的表达.因此,经CD40L修饰的K562细胞可成为有效的基因工程肿瘤疫苗.本研究也为将来构建CD40L体系打下了基础.
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