阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的中枢神经退行性疾病，目前临床上还缺乏有效的治疗药物。β淀粉样蛋白(Amyloid β，Aβ)的沉积作为AD病变的始发因素和中心环节，使得对抗Aβ的形成、沉积及毒性作用成为治疗AD的根本策略。 Curcumin(Curcumin)是从植物姜黄中提取的单体，是天然的酚类抗氧化剂和脂氧合酶、环氧化酶、黄嘌呤脱氢酶及iNOS等反应性氧合酶的强抑制剂，也是蛋白激酶C、EGF受体酪氨酸激酶及Ikappaβ激酶的抑制剂和抗血管生成剂。上世纪90年代中期开始了Curcumin抗癌作用研究的热潮，自2000年发现Curcumin具有抑制Aβ产生和聚集的作用后，迅速展开了Curcumin防治AD作用机理的探讨，Curcumin也由此被美国加利福利亚大学阿尔茨海默病研究中心纳入防治AD的重点药物研究项目。目前研究发现Curcumin是Aβ的强抑制剂，不仅可明显抑制Aβ的产生与聚集，而且其抗炎和抗氧化作用还能减轻AD患者脑内的炎性反应和氧化损伤。Curcumin易于通过血脑屏障，而且其天然成分的低毒性等特点均使Curcumin成为极具开发价值和潜力的防治AD的理想药物。 研究发现Curcumin对Aβ具有很强的抑制作用，而且Curcumin的许多衍生物对Aβ的产生和聚集也表现出不同程度的抑制作用，提示Curcumin及其衍生物的化学结构或活性基团可能与抑制Aβ的机理有关，因此研究Curcumin抑制Aβ的机制成为近年来关注的热点。最新的研究表明Wnt／β连环蛋白(β-catenin)信号通路与AD的发生、发展密切相关，钙连蛋白E(E-cadherin)可能作为中心枢纽介导早老素-1(PS-1)与β-catenin信号分子之间形成蛋白复合物，其中PS-1是γ分泌酶的主要成分，后者不仅是合成Aβ的关键酶，又是Wnt信号通路的负调节分子，可促进β-catenin降解。有文献报道Curcumin可使转染了APP695sw基因的N2A细胞表达E-cadherin升高。我们推测E-cadherin升高可增加PS-1／E-cadherin／β-eatenin复合物的形成，从而减少游离PS-1和β-catenin含量。一方面PS-1减少可影响γ-分泌酶的活性和稳定性，使Aβ代谢改变；另一方面β-catenin减少可影响β-catenin核转移，使β-catenin在核内启动靶基因的表达受到抑制并阻断Wnt信号通路的转导。由于PS-1／E-cadherin／β-catenin复合物与γ-分泌酶和Wnt信号通路存在双重关系，而γ-分泌酶和Wnt信号通路均与AD的发病机制有关，因此我们推测PS-1、E-cadherin和β-catenin三者在细胞内是以蛋白复合体的形式存在，而Curcumin通过上调E-cadherin的表达，使PS-1／E-cadherin／β-catenin蛋白复合体形成增加，导致游离PS-1和β-catenin减少，继而通过影响Aβ代谢和Wnt信号转导通路，发挥对AD的治疗作用。本研究的目的在于证实上述Curcumin治疗AD的分子机制，以期确立Curcumin及其衍生物的有效活性基团，开发出理想的AD治疗中药。 材料与方法： 1.体外培养SH-SY5Y细胞株：复苏冻存的SY5Y细胞，每隔三天半量换液。 2.化学合成法合成Curcumin及其衍生物P1、P2、P3、P4：10mmol三氧化二硼(硼酐)与20 mmol乙酰丙酮在10 mmol硼酸三丁酯作用下80℃反应2h。取代苯甲醛20 mmol和0.5 mmol正丁胺溶于50mL乙酸乙酯，80℃反应过夜。加入稀盐酸水溶液，60℃1h。有机溶剂萃取，重结晶获取Cureumin及其衍生物纯品P1、P2，P3，P4。 3.建立Aβ42细胞损伤模型：SH-SY5Y细胞培养3天后，加入不同浓度的Aβ42(30、15、10、5、2.5μmol)继续培养24h。 4.MTT法检测细胞活性：根据不同浓度Aβ42对SH-SY5Y细胞的损伤作用绘制剂量效应曲线，选择15μmol Aβ42组作为细胞损伤模型的浓度用于后续实验。 5.Curcumin及其衍生物对Aβ42损伤的保护作用：向Aβ42损伤模型组分别加入10μg/mlCurcumin及其衍生物P1、P2、P3、P4，培养24h后用MTT检测细胞活性。 6.免疫荧光三标染色检测β-catenin、PS-1和E-cadherin蛋白复合体的细胞内定位：分别用E-cadherin羊抗大鼠单克隆抗体、β-catenin羊抗小鼠单克隆抗体、PS-1羊抗兔多克隆抗体孵育细胞，使三种抗体分别与β-catenin、PS-1和E-cadherin蛋白结合。用三种二抗FITC标记羊抗小鼠二抗、Cy3标记羊抗大鼠二抗、Alexofluro405标记羊抗兔二抗孵育细胞后，激光共聚焦显微镜下观察β-catenin、PS-1和E-cadherin蛋白的细胞内定位。 7.免疫共沉淀法检测β-catenin／PS-1／E-eadherin蛋白复合体：细胞裂解液裂解SY5Y细胞后，分别用PS-1或E-cadherin或β-catenin一抗与相应的蛋白结合，再用琼脂糖珠子与一抗结合，使琼脂糖珠子、蛋白和抗体三者结合。低速离心使蛋白随琼脂糖珠子沉淀，沉淀的蛋白经电泳、转膜后，同时加入PS-1、E-cadherin、和β-catenin一抗与膜孵育，再与HRP标记的二抗结合，用化学发光剂使蛋白条带显色，根据蛋白Mark的分子量判断目的条带。 8.Westem blot检测E-cadherin蛋白表达：分别在Aβ42细胞损伤模型组加入Curcumin及其衍生物P1、P、P3、P4孵育24h后，检测细胞内E-cadherin蛋白表达量。 结果 1.经质谱和核磁共振技术检测Curcumin及其衍生物P1、P2、P3、P4的化学结构，证实Curcumin及其衍生物的结构与原设计的结构相符，其主要差异在分子两端芳香环上的取代基不同。衍生物P1与母体Curcumin(P2)比较，去掉了芳香环上的所有取代基；P3则将4位羟基甲醚化，并增加了一个5位甲氧基；P4则去掉了3位甲氧基，保留了4位酚羟基。 2.30、15、10、5、2.5μmol／L Aβ42分别加入SH-SY5Y细胞24h后，SH-SY5Y细胞存活率分别下降到正常对照组的21.9％、67.2％、79.8％、91％、93％，提示不同浓度Aβ42对SH-SY5Y细胞具有毒性作用。 3.将15μmol／L Aβ42和10μg/ml Curcumin及其3种衍生物同时加入SH-SY5Y细胞孵育24h后，发现Curcumin及其衍生物P4能对抗Aβ42的神经毒性作用，使SH-SY5Y细胞的存活率上升24％、30％。 4.激光扫描共聚焦显微镜下可见PS-1、E-cadherin和β-catenin三种蛋白在SH-SY5Y细胞内的分布有重叠，提示PS-1、E-cadherin和β-catenin三种蛋白的细胞内定位有相互关系。再经免疫共沉淀证实PS-1／E-cadherin／β-catenin在细胞内形成蛋白复合物。 5.Western blot检测Curcumin及其衍生物孵育SH-SY5Y前、后细胞内E-cadherin蛋白表达量的改变，通过比较给药前、后的灰度值，发现给药后E-cadherin蛋白表达量增高。 结论 1.Aβ42对SH-SY5Y细胞株具有神经毒性作用，且毒性作用与Aβ42的浓度呈正相关。 2.Curcumin及其衍生物的母体结构二芳基庚酮是对抗Aβ42损伤的基本结构。衍生物P4去掉了芳香环上的3位甲氧基并保留了4位羟基，因而其对抗Aβ42损伤的作用更强于Curcumin本身。衍生物P1和P3去掉了芳香环上的4位羟基，因而均失去了对抗Aβ42的损伤作用。我们认为Curcumin的母体结构二芳基庚酮和芳香环上的4位羟基是Curcumin及其衍生物P4发挥细胞保护作用的关键化学结构和活性基团，而3位甲氧基对4位羟基有抑制作用。 3.免疫荧光三标染色从形态学角度证实了PS-1、E-cadherin和β-catenin三种蛋白在细胞内存在空间分布上的密切联系。免疫共沉淀法从分子结构上证实了这种空间联系实则为形成PS-1／E-cadherin／β-catenin蛋白复合体，这将为探讨Wnt／B-catenin信号通路与AD发病机制之间的关系提供了重要的理论和实验基础。 4.Western blot检测证实Curcumin能使E-cadherin蛋白表达上调。鉴于本实验已证实PS-1／E-cadherin／β-catenin三者在细胞内以蛋白复合体的形式存在，因此我们认为Curcumin及其衍生物P4通过上调E-cadherin蛋白表达，使PS-1／E-cadherin／β-catenin蛋白复合体形成增加，导致游离PS-1和β-catenin减少，PS-1和β-catenin的降低影响了Aβ代谢的有关酶类和核内Wnt信号通路的转导，从而发挥对AD的治疗作用。