红松种胚发育过程中激素动态与关键调控基因解析

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红松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.)是裸子植物门松科松属高大乔木树种,是温带地带性顶极群落—红松阔叶林的建群树种,是优质的用材和坚果生产树种,具有重要的生态和经济价值。本研究分别以处于原胚期(S1)、裂生多胚期(S2)、柱状胚期(S3)、子叶胚前期(S4)不同发育阶段的红松种胚作为材料,采用石蜡切片的苏木精染色技术跟踪监测并解析红松胚胎发育的形态演变过程,探讨内源激素格局与胚胎发育形态演变之间的关系,在此基础上采用Illumina转录组测序与iTRAQ蛋白组学技术的关联分析揭示调控红松胚胎发育差异表达基因的代谢通路和分子调控网络,挖掘参与红松重要胚胎发育时期转变和维持的关键基因。主要研究成果如下:  (1)红松胚胎发育遵循松属的胚胎发育过程,即从受精卵开始先后经历原胚期、裂生多胚期、柱状胚期、子叶胚前期、子叶胚期。胚胎发育过程存在胚胎模式构建、多胚的选择与消除、胚柄的消除等关键阶段,胚柄短暂存在及多胚并存最终保留1个主导胚成熟,这是红松胚胎发育的显著特点。  (2)内源激素含量和比值随着胚胎形态发育发生动态变化。在红松胚胎发育四个阶段IAA和ABA含量均维持在较高的水平;GAs含量全程较低;ZR含量发育全程呈现下降的变化趋势;IAA的含量呈现先增加后降低的变化趋势,柱状胚期含量达到峰值,随后降低;GAs含量呈现先降低后增加的动态变化趋势;ABA含量呈现先上升后递减的变化趋势,裂生多胚期达到峰值,随后含量逐渐降低;GAs+IAA+ZT/ABA的值呈现先增加后降低的变化趋势,柱状胚期达到最大值。在胚胎发育早期生长促进激素与生长抑制激素间的高比值有利于胚胎形态建成及器官的分化,胚胎发育成熟后期,低比值有利于种子和胚胎的进一步成熟。  (3)差异表达的蛋白与基因主要富集在新陈代谢、次生代谢产物合成、内质网的蛋白质加工、淀粉和蔗糖代谢、氧化胁迫、激素信号转导等路径。  (4)通过从头(De novo)测序技术构建了红松胚胎发育过程的转录组图谱。主要包括以下几个方面:①生长素生物合成及信号转导涉及的YUC家族基因、TCP8转录因子、TIR1/AFB及ARF在柱状胚期上调表达,GH3家族基因下调表达,通过促进IAA合成与信号传导进而促进胚胎模式构建相关基因的表达;裂生多胚期ABA合成代谢及信号转导相关基因NCED、ZEP、PYR/PYL、SnRK2上调表达,CYP707A下调表达,通过促进ABA合成与信号传导进而促进胚胎成熟过程中储藏蛋白相关基因表达。②胚胎模式构建的基因WOX8、CLV、 PLT、 SCR、NIP1-1、PLT在胚胎分生组织、子叶、胚柄、胚根等器官形成发育的关键时期(裂生多胚、柱状胚期或子叶胚前期)上调表达。③Metacaspase、VEIDase、 HSPs、抗氧化及PCD相关酶类的编码基因呈现在原胚期和柱状胚期这两次PCD高峰期上调表达。④在裂生多胚期、柱状胚期vicilin、legumin、globulin、LEA等储藏类蛋白相关的基因上调表达,子叶胚前期下调表达。⑤原胚期促进细胞分裂、生长与细胞壁重塑的基因PCNA、Chitinase、XTH、AGPs显著上调表达。  (5)运用iTRAQ蛋白组学技术分析鉴定出差异蛋白2271个,转录组学和蛋白质组学的关联分析鉴定出19个差异蛋白。涉及参与抗氧化与PCD过程的蛋白、胚胎发育晚期的储藏类蛋白、激素代谢和信号转导途径的蛋白几类。①生长素合成途径YUC蛋白在原胚期上调表达,证实红松幼胚的器官分化需要高浓度的IAA。②PCD和抗氧化酶类metacaspase、POD、GST及HSPs相关的蛋白均呈现在原胚期或柱状胚期这两次PCD高峰期上调表达。③legumin、globulin、vicilin、LEA等储藏蛋白在胚胎发育中后期富集,促进胚胎和种子的进一步成熟。④促进细胞分裂、生长和细胞壁重塑的AGPs在原胚期显著上调表达,印证了快速的细胞分裂和细胞壁重塑是原胚期的显著发育特征。
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