杂色鲍幼苗“掉板症”病原及致病机制研究

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2001~2006年间,广东、福建、海南和台湾沿海养殖的杂色鲍(Haliotisdiversicolor Reeve)在育苗过程中陆续暴发大规模不明原因死亡,主要表现为鲍幼体附着于附着基(波纹板、薄膜等)后第7~20天出现大量死亡,这种鲍苗从附着基上脱落死亡的现象,鲍养殖业内称之为“掉板症”或“脱板症”。我们从育苗环境的理化因子和生物因子着手,分析病因,排除了环境理化因子、寄生虫等的直接影响;超微切片结果也未发现病毒粒子。而在对发病期鲍苗培育环境中的细菌数量的分析中发现,发病前后细菌数量有显著变化,推测鲍幼苗的发病跟细菌有关系。通过分离纯化,从病鲍体内获得了一株毒力很强的病原菌,命名为菌株NA0301,菌株NA0301的48 hr半致死浓度LD50=2.25×106 CFU/mL。经生理生化特性鉴定和16S rDNA、rpoA基因等分子标记的序列分析,最终鉴定病原菌株NA0301为溶珊瑚弧菌(Vibrio corallilyticus)。回归感染试验结果确认溶珊瑚弧菌NA0301是杂色鲍幼苗“掉板症”的主要致病菌之一。   rpo A基因是一个看家基因,在同一弧菌属不同种间的变异度在一般在88%~98%间,相似度小于88%一般属于不同属的菌株。本研究据此建立了一套可行的弧菌鉴定方法。本研究除了应用分析rpo A基因来鉴定弧菌外,在菌株NA0301的rpo A基因序列分析的基础上设计并合成了一套环介导等温扩增(LAMP)特异性强的引物,成功建立了对溶珊瑚弧菌LAMP检测方法,检测特异性强,与多种其他病原弧菌、肠道菌以及环境菌均未出现交叉反应,检测灵敏度高,基因组DNA的最低检测限小于66fg;细菌纯培养物检测限为36 CFU/mL。   溶珊瑚弧菌NA0301的胞外产物具有强的生理活性,具有蛋白酶活性、溶血活性和淀粉酶活性。其中,在盐度为2.6%,pH为10.0,温度为28℃的培养条件下溶血活性最强。分析了胞外产物在不同条件下的酶活力稳定性,胞外产物在煮沸10min或60℃温浴1 hr的实验条件下,均可同时失去溶血酶、淀粉酶、蛋白酶活性;37℃水浴2 hr以上酶活性下降。菌株NA0301能分泌铁载体,该铁载体对铁离子的络合力介于镉天青和8-羟基喹啉之间。胞外产物对鲍具有毒性,能在48hr内致使实验鲍死亡。胞外产物和洗涤后的菌体的毒性试验结果比较表明,胞外产物在菌株NA0301对鲍的致病过程中起着重要作用。组织病理学和免疫组织化学研究结果显示,病原菌入侵鲍体后,主要靶器官为肝组织、唾液腺、外套膜;4hr后即可在肝组织、唾液腺、外套膜等组织中发现病原弧菌NA0301。病鲍的鳃丝、肝组织、肌丝、消化腺等有不同程度的受损,各组织中出现空泡化,呈现明显的病理损伤特征。鲍在注射感染了菌株NA0301后,部分免疫因子呈现出一定的变化规律,在注射感染病原菌的第1、2 hr,AKP和ACP酶活力均比对照组低,当注射感染后第6~48 hr,AKP和ACP酶活力均大幅上升,明显高于对照组。SOD和POD活力在注射2hr内和注射后8hr以后,活力水平均明显低于对照组。这4种主要免疫因子的酶活力变化表明杂色鲍的血淋巴在病原菌NA0301开始入侵体内时即发挥了重要的作用,伴随着释放出大量与免疫清除相关的水解酶ACP、AKP、POD、SOD等,可以通过测定鲍血清中ACP、AKP等部分免疫因子来推算鲍的非特异性免疫水平。本研究初步阐明了溶珊瑚弧菌对鲍的致病机制以及感染病原菌后鲍的部分免疫因子变化规律。   药物敏感实验结果表明,溶珊瑚弧菌NA0301对利福平、氯霉素和环丙沙星等高度敏感,对万古霉素、克林霉素等有强耐药抗性。中草药抑制病原菌实验结果显示,中草药夹竹桃叶、苦楝叶、芒果叶和羊蹄甲叶对溶珊瑚弧菌有抑制作用,其中芒果叶的乙酸乙酯萃取部位对NA0301的抑制作用最强。在进行的药物控制循环水养殖实验中,实验组获得了40天内育苗期期间保持67.7~71.2%的鲍苗成活率,与对照组差异显著(P<0.05)。为预防和控制因溶珊瑚弧菌NA0301引起的鲍幼苗病害提供了科学依据。
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