光片荧光显微用一层光束薄片从侧面激发样品,并在垂直于光片的方向上用显微物镜和相机拍摄样品荧光图像,通过轴向扫描光片或移动样品逐面成像,获取不同深度处的层析图像并实现样品三维信息重构。与共聚焦显微技术相比,光片荧光显微因具有三维层析成像速度快、光漂白弱和光毒性小等优点成为了生命科学领域中重要的三维成像工具。目前光片荧光显微系统大多使用高斯型光片场,大视场观测需以牺牲图像质量和轴向分辨率为代价。扫描贝塞尔光束生成的光片虽然能扩大观测视场,但它的同心环状旁瓣会产生较强的离焦背景,降低图像信噪比和轴向分辨率。如何在不损失轴向分辨率的前提下扩大光片荧光显微成像系统的观测视场是光片荧光显微技术中亟待解决的问题。本文提出并生成了贝塞尔光束的互补光束,分别扫描贝塞尔光束和互补光束拍摄荧光图像,取其强度差值可以得到去除离焦背景的荧光图像,从而实现高时空分辨率、大观测视场的荧光三维显微成像。本文主要研究工作包含以下几方面:1、设计并优化了贝塞尔光束的互补光束。针对贝塞尔光片旁瓣激发离焦背景的问题构想出一种贝塞尔光束的互补光束,其扫描光片场恰好是贝塞尔光片的旁瓣部分。研究了贝塞尔光束和马丢光束等无衍射光束频谱的共同特征后,根据互补光片强度分布特性给出互补光束频谱的一般表达式。借助遗传算法得出互补光束频谱的最优表达式,使得互补光片强度在探测物镜焦面附近最大限度的接近贝塞尔光片旁瓣,二者相减可消除旁瓣的影响,从而获得大视场均匀的理想薄光片。2、完成了光片荧光显微系统的理论分析和光学仿真。结合标量衍射理论和啁啾z变换数值模拟了高斯光片、贝塞尔光片及其互补光片三维强度分布。利用成像理论分析了三种光片的点扩散函数和对应的调制传递函数,并对成像过程进行了数值模拟。结果表明,引入互补光片的图像相减方法既具有高斯光片轴向分辨率高,又有贝塞尔光片观测视场大的优点。3、设计和搭建一套基于空间光场调控的光片荧光显微成像系统,实现高轴向分辨率、大观测视场三维成像。设计并搭建了基于纯相位型空间光调制器的光场调控模块,将波前调制后的光场耦合入扫描振镜模块,建立起一套可以生成多种扫描光片场的光片荧光显微系统。分别用高斯光片、贝塞尔光片和光针光片对4微米直径的荧光小球和e-GFP标记的鼠脑切片成像,分析了不同光片对系统成像性能的影响。