复制蛋白A(Replication protein A,RPA)是真核细胞中主要的单链DNA(ss DNA)结合蛋白,是具有高度灵活的模块化蛋白质,被视为ss DNA的第一应答者。RPA在细胞中主要起到保护单链不被其他核酸蛋白酶降解,并防止单链形成二级结构的作用。同时RPA通过与其他蛋白质的相互作用,为其他蛋白质进入作用位点提供平台。RPA还起到感应由多种来源引起的基因组损伤的传感器作用。G-四链体(G4)结构由富含连续鸟嘌呤的DNA序列折叠形成的四链螺旋结构,G4结构一旦形成,就具有较高的热稳定性。在基因的复制、转录和修复中G4通常被视为一种障碍,为了快速去除G4DNA结构,需要解旋酶或其他蛋白将其打开,否则将影响基因代谢。基于基因组测序结果,生物体内有超过70万的潜在G4折叠位点。RPA在行使保护单链和招募其他蛋白互作的过程中,可以将部分G4结构打开。RPA指导DNA加工的能力,在很大程度上,取决于RPA在各种加工途径上与其他蛋白的互作,细胞内几乎所有的DNA加工途径都需要RPA的参与,例如RPA参与的G4代谢过程。目前已经发现RPA可以抑制位于前导链和后随链上的G4形成,RPA的突变导致细胞内G4大量累积,还发现RPA可以与其他解旋酶共同作用,消除位于前导链和后随链上的G4结构。但是目前观察到的这些结果都是在细胞水平,他们的具体机制是什么还不清楚。我们的研究用生化方法在体外解释了RPA抑制G4形成的机制,具有一定生理意义。DNA复制、转录、修复过程中,如果瞬时暴露的ss DNA含有G4折叠位点,在体内是否真正折叠成G4结构仍不清楚。G4结构一旦形成,RPA能否将其打开?RPA是否对不同G4结构具有偏好性,以及它的解旋机制是什么也不清楚。早有文献报道RPA具有招募其他蛋白质的功能,在单分子水平上,RPA如何与其他解旋酶互作解旋G4底物仍然未知。本研究主要采用单分子荧光共振能量转移的技术,同时结合圆二色谱和FRET熔化实验,研究RPA与G4 DNA的相互作用。本实验主要有以下几点结论:首先,RPA干预G4结构的形成。潜在G4序列瞬时暴露时,不一定折叠成结构,其主要取决于G4序列内在的折叠速率与RPA对ss DNA结合速率的差异,与G4的稳定性、序列长度、RPA浓度密切相关。第二,对于已经折叠的G4结构,RPA以不同行为、有选择性的将其展开。我们提出一种G4 DNA呼吸的机制,并将RPA的展开G4行为归为三类:a、持续打开低稳定性G4,并以多个RPA分子稳定打开的单链;b、以快速打开-折叠的方式打开稳定性较高,但存在自发呼吸现象的G4,包括Myc G4;c、RPA对不存在呼吸现象的多层G4及长Loop G4几乎无破坏作用。第三,RPA与Pif1或BLM解旋酶协同作用,在解旋G4时产生新现象,将G4结构稳定在持续展开的状态,极大的提高了G4结构的解旋效率。本论文揭示了RPA在G4 DNA的折叠与打开过程中具有多重功能,对于深入理解DNA复制、转录、修复和端粒代谢过程中,细胞对G4结构的微观调节机制具有重要意义。