论文部分内容阅读
晶状体后囊膜混浊(posterior capsule opacification，PCO)是白内障术后导致视力下降的最主要并发症，术后5年内的发生率为28.4％。在儿童，若术中保留后囊膜，则PCO的发生率几乎100％。白内障术后赤道部残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)过度增殖、移行和分化是PCO形成的根本原因。激光后囊膜切开术是目前治疗PCO的主要方法，但有可能引起相应的并发症。在儿童，由于其无法配合，这一方法也难以适用。而现有的预防PCO发生的各种方法，如白内障手术技术的改进、IOL设计的完善、以及各种抗增殖药物的应用，虽然在一定程度上降低了PCO的发生率，但都没有从根本上解决这一问题。因此，探索新的PCO防治途径具有重要意义。近年来，PCO基因治疗的研究取得一定进展，研究主要集中于自杀基因、细胞周期调控基因和细胞因子相关基因。这些方法为PCO的治疗提供了新思路，但仍存在一些缺陷。本研究拟通过促凋亡基因的转导来实现对LECs增殖的抑制。BAX是主要的促凋亡基因。研究表明BAX基因体外或体内转染肿瘤细胞可有效抑制肿瘤细胞的生长，或明显增强放疗或化疗对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究对体外培养的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLECs)进行BAX基因的转染，检测转染后BAX、BCL2基因表达的变化，观察BAX基因转染对HLECs形态、超微结构、活化型半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)3表达的影响，验证BAX基因转染对HLECs凋亡的作用，探讨促凋亡基因治疗PCO的可能性。第一部分改良电穿孔法和脂质体法转染人晶状体上皮细胞效率的比较目的比较脂质体法和改良电穿孔法(Nucleofector)转染HLECs的转染效率。方法体外培养HLECs系SRA01／04。将携带BAX基因的质粒C3-EGFP-BAX少量扩增后鉴定，鉴定序列正确后将C3-EGFP-BAX质粒与空质粒C3-EGFP中量扩增与纯化。用脂质体和Nucleofector两种方法将C3-EGFP质粒转染HLECs，用细胞计数法和流式细胞仪法检测转染效率。结果HLECs系SRA01／04体外培养生长良好，符合HLECs的性状，数量满足实验需求。C3-EGFP-BAX质粒鉴定的结果与预期的序列完全符合，C3-EGFP-BAX与C3-EGFP质粒扩增后浓度与纯度均满足基因转染的要求。HLECs能用Nucleofector与脂质体两种方法成功转染，转染后48hr，脂质体法的转染效率为45.3％±10.5％，Nucleofector法的转染效率为78.3％±17.5％。结论HLECs能用Nucleofector与脂质体两种方法成功转染，Nucleofector法的转染效率更高。第二部分BAX基因转染人晶状体上皮细胞及对BCL2基因表达的影响目的观察C3-EGFP-BAX质粒转染后HLECs BAX基因的表达情况及BCL2基因表达的变化。方法对体外培养的HLECs的BAX和BCL2基因的基础表达情况进行检测。再用Nucleofector技术对其进行BAX基因转染。转染后48hr，用荧光定量RT-PCR的方法检测BAX基因mRNA的表达，Western免疫印迹法、细胞免疫荧光法检测BAX蛋白的表达。用同样的方法检测BCL2基因表达的情况。以转染空质粒C3-EGFP的细胞和未经转染的细胞作为对照。结果转染后48hr，HLEC-EGFP-BAX组细胞BAX基因mRNA的相对表达量是HLEC-EGFP组的2.70倍，BAX蛋白表达量是HLEC-EGFP组的2.30倍，两组间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。HLEC-EGFP-BAX组细胞BCL2基因mRNA的相对表达量是HLEC-EGFP组的97.7％，BCL2蛋白表达量是HLEC-EGFP组的60.1％，两组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。HLEC-EGFP-BAX组细胞BAX与BCL2基因mRNA表达量的比例BAX／BCL2是HLEC-EGFP组的2.72倍，蛋白表达量的比例BAX／BCL2是HLEC-EGFP组的3.83倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论对于正常培养的HLECs，BAX和BCL2两种蛋白均有表达，均位于胞浆中。C3-EGFP-BAX质粒转染HLECs后，BAX基因的表达增强，BAX基因和BCL2基因表达量的比例BAX／BCL2也明显升高，但BCL2基因的表达无明显变化。第三部分BAX基因转染对人晶状体上皮细胞凋亡的作用研究目的验证BAX基因转染对HLECs凋亡的作用。方法BAX基因转染后，使用流式细胞仪Annexin V染色法检测转染成功的HLECs的死亡情况，相差显微镜和荧光显微镜观察HLECs的形态改变，Hoechst染色法观察HLECs核的改变，透射电镜观察HLECs超微结构的变化，Western免疫印迹法检测活化型caspase 3(CASP3)蛋白表达的变化。以转染空质粒C3-EGFP的细胞和未经转染的细胞作为对照。结果BAX基因转染后，转染成功的HLECs的死亡率约为40％，转染空质粒的细胞的死亡率约为30％，两组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，不同时间点的死亡率的差别无统计学意义(P＞0.05)。形态学的方法观察到经BAX基因转染的细胞其生长状态差，轮廓模糊，细胞核变小，核染色质固缩、边集，并可见核碎裂。Western免疫印迹法检测到HLEC-EGFP-BAX组活化型caspase 3的表达量是HLEC-EGFP组的2.44倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论BAX基因转染可以诱导HLECs死亡，死亡的主要方式是凋亡。全文小结1．HLECs能用Nucleofector与脂质体两种方法成功转染，平均转染率分别为78.3％和45.3％。2．BAX和BCL2两种蛋白在正常培养的HLECs中均有表达。BAX基因转染能增强BAX蛋白的表达，对BCL2的表达无明显影响，从而使BAX和BCL2表达量的比例BAX／BCL2升高。3．BAX基因转染可以诱导HLECs死亡，死亡的主要方式是凋亡。