背景与目的1.药物诱导γ-珠蛋白基因表达可有效治疗β-地中海贫血γ-珠蛋白基因活化是治疗β-地中海贫血的行之有效的方法之一,是用药物诱导出生后已关闭的γ-珠蛋白基因重新开放并有效表达,改善α-和非α-珠蛋白链合成的不平衡,增加胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin, Hb F,α2γ2)合成,以达到减少溶血,缓解贫血症状的目的。迄今为止,已发现多种药物具有诱导γ-珠蛋白基因表达和/或促进Hb F合成的作用。但不少药物存在着疗效差、毒副作用大或体内半衰期短等缺点,因此有必要开发和寻找安全高效的新药物用于治疗β-地中海贫血等血红蛋白病。2.药物诱导γ-珠蛋白基因表达的作用机制阐明药物诱导γ-珠蛋白基因表达机制是开发和设计高效安全药物的前提,然而目前对药物如何调控γ-珠蛋白基因重新表达、进而增加Hb F合成的作用机制尚未完全清楚。不同药物的作用机制不尽相同,目前已知的大体上可归纳为三种模式：(1)通过改变基因启动子区域染色质结构,开放染色质,促使γ-珠蛋白基因表达；(2)通过不同细胞信号通路来调控γ-珠蛋白基因表达；(3)通过改变红系细胞分化动力学来使γ-珠蛋白基因延迟关闭,提高Hb F合成。3. p38MAPK信号介导药物诱导γ-珠蛋白基因表达的重要作用p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)是主要的MAPK信号通路之一。自从10多年前发现p38MAPK信号通路介导药物诱导Hb F合成以来,此信号在药物诱导γ-珠蛋白基因表达的作用越来越受到重视。目前发现许多药物如短链脂肪酸类、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制剂、细胞毒性药物、甚至DNA甲基转移酶(DNA methytransferase, DNMT)抑制剂等都可通过这一信号通路来发挥诱导作用。由于这些药物在药理学上有明显的区别,但它们都能通过p38MAPK信号来介导γ-珠蛋白基因表达,因此p38MAPK信号通路可能是作用机制中的重要环节。鉴于p38MAPK的重要作用,阐明p38MAPK信号介导γ-珠蛋白基因表达的机制对于揭示药物诱导γ-珠蛋白基因的作用机制具有重要意义。但目前对p38MAPK信号如何介导γ-珠蛋白基因表达还不明了,比较明确的是p38MAPK可通过激活转录激活蛋白如cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)、激活转录因子2 (activating transcription factor 2, ATF2)等来介导γ-珠蛋白基因表达。4.本课题组对p38MAPK信号调控γ-珠蛋白基因表达的前期研究工作本课题组先前对p38MAPK信号调控γ-珠蛋白基因表达进行了较为深入的研究：(1)构建了稳定表达高低磷酸化p38MAPK的K562转染细胞模型用于研究。(2)首次发现除转录因子CREB和ATF2外,GATA-1活化与p38MAPK信号介导的γ-珠蛋白基因表达有密切关系。(3)通过构建siRNA敲低GATA-1的K562细胞进一步验证了GATA-1在p38MAPK信号介导γ-珠蛋白基因表达中的作用。5.染色质表观遗传修饰对γ-珠蛋白基因表达的影响基因表达调控不仅受转录因子的影响,还与染色质结构、DNA及组蛋白表观遗传修饰的动态变化有关。近年发现,染色质表观遗传修饰在生长发育过程中β-珠蛋白基因簇不同基因表达转换的“开”与“关”中起着关键作用。某些γ-珠蛋白基因诱导药物,如DNMT抑制剂、HDAC抑制剂、短链脂肪酸等,同时也是表观遗传修饰的诱导剂,可以通过DNA去甲基化、组蛋白乙酰化来促使γ-珠蛋白基因表达,但此方面的研究还比较少。6.研究假设：p38MAPK信号可能通过影响基因启动子区域表观遗传修饰来调控γ-珠蛋白基因表达目前已有的研究只揭示了数个转录相关因子如CREB、ATF2、GATA-1与p38MAPK信号介导γ-珠蛋白基因表达有关,阐明p38MAPK对γ-珠蛋白基因的作用机制仍需更多的研究。目前已知p38MAPK信号激活可以活化CREB,而CREB的结合蛋白CBP和p300具有组蛋白乙酰基转移酶活性,能直接引起组蛋白乙酰化。另外,丁酸盐类药物具有HDAC抑制活性,既可通过乙酰化组蛋白、也可通过激活p38MAPK信号来诱导γ-珠蛋白基因表达。那么p38MAPK信号对γ-珠蛋白基因启动子区域的表观遗传修饰有何影响?我们假设p38MAPK信号除了可以直接作用于转录因子外,尚可通过介导γ-珠蛋白基因启动子区域表观遗传修饰的变化来调控γ-珠蛋白基因表达。有关p38MAPK与γ-珠蛋白基因启动子组蛋白乙酰化的研究报道不多,且尚有不同的意见,而p38MAPK信号对γ-珠蛋白基因启动子组蛋白磷酸化、DNA甲基化的作用尚未见报道,这是本研究的创新性之所在。7.研究目的和意义本研究利用丁酸钠(sodium butyrate, NaB)诱导的高磷酸化p38MAPK的K562细胞和稳定表达高/低磷酸化p38MAPK的K562转染细胞模型,通过检测不同磷酸化p38MAPK水平下γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白乙酰化、磷酸化和DNA甲基化的变化,探讨p38MAPK信号对γ-珠蛋白基因启动子区域表观遗传修饰的影响。研究成果将为揭示药物诱导γ-珠蛋白基因作用机制提供新的科学证据,对于开发和设计新药用于治疗β-地中海贫血等血红蛋白病具有指导意义和应用价值。方法1.细胞培养本研究实验对象为具有红系分化潜能的人红白血病K562细胞株和用于对照的不表达珠蛋白的人宫颈癌Hela细胞株。两种细胞均用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基在37℃、5% CO2培养箱中培养。2.表达不同磷酸化p38MAPK水平的K562细胞模型的建立2.1 NaB处理K562细胞模型的建立及分组用终浓度0.5mmM的NaB处理K562细胞48h,建立NaB诱导的高磷酸化p38MAPK细胞[K562(NaB)]。用p38MAPK特异抑制剂SB203580(终浓度10μM)预处理1h后再用NaB处理48h的K562细胞来建立抑制剂处理细胞[K562(SB+NaB)]。用于空白对照的K562亲本细胞(K562)。2.2稳定表达高/低磷酸化p38MAPK的K562转染细胞的建立及分组本课题组先前已建立了稳定表达高/低磷酸化p38MAPK的转染K562细胞和用于对照实验的转染空载体的K562细胞。细胞分组：(1)稳定表达高磷酸化p38MAPK的转染K562细胞(K562-MKK3-Glu);(2)稳定表达低磷酸化p38MAPK的转染K562细胞(K562-MKK3-Ala);(3)转染空载体的K562细胞(K562-vector);(4)SB203580预处理1h的稳定表达高磷酸化p38MAPK的转染K562细胞[K562-MKK3-Glu(SB)];(5)K562亲本细胞(K562)。3.表达不同磷酸化p38MAPK水平的K562细胞模型的鉴定用RT-PCR方法检测p38MAPK、Gy-和Aγ-珠蛋白mRNA的相对水平；用western blot方法检测总p38MAPK、磷酸化p38MAPK和Hb F水平。4.γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白乙酰化和/或磷酸化分析采用基于real time PCR分析的染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)技术分别分析Gγ-、Aγ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白H3和H4乙酰化(acetylated H3 and H4, acH3 and acH4)、组蛋白H3磷酸化/乙酰化(phosphorylated/acetylated H3, ph/acH3)水平。5.γ-珠蛋白基因启动子DNA甲基化分析采用基于亚硫酸氢盐处理的直接测序法分析γ-珠蛋白基因启动子DNA甲基化水平。6.统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示。多个样本均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA)。方差齐性检验如方差齐时多重比较采用LSD方法检验；如方差不齐时方差分析采用近似F检验Welch法,多重比较采用Dunnett’s T3方法检验。检验水准为a=0.05。结果1.K562细胞模型的鉴定1.1不同K562细胞模型的p38MAPK基因表达水平无差异RT-PCR结果显示,药物处理的K562细胞和不同的K562转染细胞的p38MAPK mRNA水平无显著差别(F=2.420,P=0.081)。1.2不同K562细胞模型的总p38MAPK和磷酸化p38MAPK水平不同K562细胞模型的总p38MAPK水平无显著差别(F=0.302,P=0.926)。但各组间磷酸化p38MAPK水平差异有显著性(F=8154.574,P=0.000),其中K562(NaB)和K562-MKK3-Glu细胞的磷酸化p38MAPK水平高于K562细胞,分别升高了4.2和4.3倍(P=0.000)；经SB203580预处理的K562 (SB+NaB)和K562-MKK3-Glu(SB)细胞、表达低磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Ala细胞的磷酸化p38MAPK水平与K562细胞无差别(P>0.05)。1.3不同K562细胞模型的Gγ-和Aγ-珠蛋白mRNA水平K562(NaB)和K562-MKK3-Glu细胞的Gγ-珠蛋白mRNA水平均比K562细胞高约1.4倍(P=0.000),而SB203580可降低这两种细胞的Gγ-珠蛋白mRNA水平。K562-MKK3-Ala细胞的Gγ-珠蛋白mRNA水平与和K562细胞无差别(P>0.05)。除K562-MKK3-Ala细胞Aγ-珠蛋白mRNA水平低下外,其他各组细胞的Aγ-珠蛋白mRNA水平无显著差别(P>0.05)。1.4不同K562细胞模型的Hb F水平K562(NaB)和K562-MKK3-Glu细胞的Hb F水平均比K562细胞升高了约3.4倍(P=0.000),同样地,SB203580可降低这两组细胞的Hb F水平。表达低磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Ala细胞的Hb F水平比K562细胞显著降低(P=0.000),降低倍数约2.4倍。2.Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域的acH3和acH4水平2.1各K562细胞组组内Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域acH3或acH4水平高于阴性对照necdin基因各个K562细胞模型组内Gγ-珠蛋白基因、Aγ-珠蛋白基因和necdin基因的acH3或acH4水平相互比较均有显著差别(P<0.05)。Gγ-、Aγ-珠蛋白基因启动子区域acH3或acH4水平均高于在K562细胞中表达沉默的necdin基因(P<0.05)。在珠蛋白基因不表达的Hela细胞,Gγ-、Aγ-珠蛋白和necdin三种基因的acH3或acH4水平相互比较无显著差别(P>0.05)。2.2 NaB可通过激活p38MAPK来提高K562细胞Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区acH3、acH4水平NaB诱导的K562(NaB)细胞的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域acH3、acH4水平均高于K562细胞,其中Gγ-acH3和Gγ-acH4水平分别升高3.1倍和2.6倍(P<0.05),Aγ-acH3和Aγ-acH4水平分别升高3.7倍和3.2倍(P<0.05)。SB203580抑制试验显示K562(SB+NaB)细胞的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区acH3、acH4水平降低,分别只有K562(NaB)细胞的48.7%和40.6%、41.8%和28.9%。2.3稳定表达高磷酸化p38MAPK的K562转染细胞模型的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区acH3、acH4水平升高稳定表达高磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Glu细胞的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域acH3和acH4水平分别比K562细胞升高3.1和2.1倍、4.2和3.2倍(P<0.05)。而持续表达低磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Ala细胞的Gγ-acH3和Gγ-acH4、Ay-acH3和Aγ-acH4水平与K562细胞相比无明显变化(P＞0.05)。SB203580预处理可降低K562-MKK3-Glu细胞的acH3、acH4水平(P<0.05)。3.Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域的ph/acH3水平3.1各K562细胞组组内Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域ph/acH3水平比阴性对照necdin基因高各个K562细胞模型组内Gγ-珠蛋白基因、Aγ-珠蛋白基因和necdin基因的ph/acH3水平相互比较均有显著差别(P＜0.05)。Gγ-、Aγ-珠蛋白基因启动子区域ph/acH3水平均高于在K562细胞中表达沉默的necdin基因(P<0.05)。在珠蛋白基因不表达的Hela细胞,Gγ-、Aγ-珠蛋白和necdin三种基因的ph/acH3水平比较无显著差别(P>0.05)。3.2 NaB可通过激活p38MAPK来提高K562细胞Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区ph/acH3水平K562(NaB)细胞的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域ph/acH3水平分别比K562细胞升高2.9倍和3.2倍(P<0.05)。SB203580抑制试验显示K562(SB+NaB)细胞的Gy-ph/acH3和Aγ-ph/acH4水平分别只有K562(NaB)细胞的39.5%和36.8%。3.3稳定表达高磷酸化p38MAPK的K562转染细胞模型的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区ph/acH3水平升高稳定表达高磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Glu细胞的Gγ-ph/acH3和Ay-ph/acH4水平也比K562细胞高,升高幅度分别为2.7和2.8倍(P<0.05)。表达低磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Ala细胞的Gγ-和Aγ-ph/acH3与K562细胞相比无变化(P＞0.05)。SB203580抑制试验显示K562-MKK3-Glu(SB)细胞的Gγ-和Ay-ph/acH3水平分别只达到K562-MKK3-Glu细胞的25.6%和14.4%。4.不同K562细胞模型的γ-珠蛋白基因启动子DNA甲基化程度低下基于亚硫酸氢盐处理的直接测序法分析DNA甲基化实验结果表明,不同K562细胞模型的γ-珠蛋白基因启动子-350、-256、-162、-53、-50、+6、+17和+50CpG位点甲基化水平均低下,各组细胞中DNA甲基化检出率为0-2.5%。而在珠蛋白基因不表达的Hela细胞,-256、-53和-50位的CpG位点甲基化率为100%,总检出率为37.5%。结论1.本实验通过建立NaB诱导的高磷酸化p38MAPK的K562细胞和稳定表达高/低磷酸化p38MAPK的K562转染细胞模型,进一步证实p38MAPK激活可以介导γ-珠蛋白基因表达,促进Hb F合成。2.建立了基于real time PCR分析的染色质免疫共沉淀实验方法用于检测γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白乙酰化和磷酸化水平。3.建立了基于亚硫酸氢盐处理的直接测序法用于分析γ-珠蛋白基因启动子DNA甲基化水平。4.证实p38MAPK激活可以升高γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白H3、H4乙酰化水平,该作用可被p38MAPK特异性抑制剂SB203580所抑制,提示促使γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白乙酰化是p38MAPK信号介导γ-珠蛋白基因表达的机制之一5.首次证实p38MAPK信号活化可提高γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白H3磷酸化/乙酰化水平,SB203580可抑制此作用,提示p38MAPK信号也可通过使γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白磷酸化来介导γ-珠蛋白基因表达。6.首次探讨p38MAPK信号对γ-珠蛋白基因启动子DNA甲基化的作用。结果显示K562细胞γ-珠蛋白基因启动子DNA甲基化程度低,与磷酸化p38MAPK水平高低无明显关系。提示在K562细胞中,p38MAPK信号可能并不通过调节γ-珠蛋白基因启动子DNA甲基化水平变化来调控基因表达。7.本研究结果提示p38MAPK信号可通过影响γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白修饰来介导γ-珠蛋白基因表达。