肿瘤免疫逃逸是抗肿瘤免疫治疗的一大障碍。近年来发现免疫检验点分子程序性死亡1(PD-1)及其配体PD-L1和PD-L2,在抑制肿瘤免疫反应中发挥着关键作用。PD-1主要表达在活化的T淋巴细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞表面。多种肿瘤通过上调表达PD-L1,从而利用PD-1:PD-L1免疫抑制通路逃避免疫监视。阻断PD-1及其配体的相互作用具有显著的临床治疗效果。截止到2017年底,已经被FDA批准的PD-1/PD-L1抑制性抗体药物达到5个,主要用于黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌等多种肿瘤。尽管针对PD-1:PD-L1途径的抗体治疗取得了不错的效果,但还是存在多数患者治疗效果不理想,治疗费用昂贵等问题。因此,开发针对免疫检验点PD-1:PD-L1的新型治疗药物很有必要。在PD-1和PD-L1抗体产生抗肿瘤效应的过程中,抗体的效应片段Fc发挥不同作用。最近研究发现,PD-L1抗体的作用有赖于Fc介导的ADCC效应,而PD-1抗体发挥作用不依赖于其Fc。并且,含有Fc的PD-1抗体其抗肿瘤活性会受到一定的抑制。提示当前应用的含有Fc片段的PD-1全分子抗体药物并不是最理想的分子形式。并且,由于全分子抗体的组织可及性和对肿瘤组织的穿透能力较差,影响治疗效果。因此很有必要发展针对PD-1的新型抗体药物。纳米抗体是从骆驼重链抗体可变区基因中,通过基因工程技术获得的小分子单域抗体。具有肿瘤穿透能力强、可接近的抗原表位数量多、生产成本相对较低和稳定性较强等特殊优势。同时纳米抗体本身不含Fc片段,这些特性对于开发针对PD-1的新型治疗性抗体非常合适。基于此,本研究的主要目的在于通过噬菌体展示技术获得结合PD-1的纳米抗体,并对其结合特异性和稳定性进行研究,为进一步开发具有治疗效果的纳米抗体提供实验基础。本研究内容分为以下三部分:1.抗PD-1噬菌体抗体展示文库的构建重组PD-1蛋白免疫新疆双峰驼,六次免疫后采集外周血分离得到淋巴细胞,然后提取淋巴细胞中的总RNA,反转录获取cDNA后利用特异性引物通过两轮巢式PCR扩增得到分子量大小约为500 bp的VHH片段。将获得的VHH片段构建到噬菌体载体上,然后将连接产物电转化到大肠杆菌TG1感受态中,次日根据长出的转化子数目计算文库容量大小并随机选取过夜培养的转化子PCR鉴定阳性率并送测序公司测序鉴定序列多样性。检测结果表明,成功构建了库容量大小为2.6×10~8 cfu/mL的VHH噬菌体展示文库,且序列多样性较高,达到100%。2.抗PD-1纳米抗体的筛选和制备利用固相亲和筛选技术对抗PD-1噬菌体抗体展示文库亲和筛选三轮,然后采用可溶性单克隆ELISA鉴定阳性克隆。将鉴定出的46个阳性克隆送公司测序,根据测序后的序列分析结果,选取了序列富集度较高的三个序列,分别命名为VHH-B7、VHH-H5和VHH-H12,然后将其从pMECS载体上亚克隆到pET22b载体上,诱导表达纳米抗体。通过亲和层析方法纯化获得大量纳米抗体。研究结果表明,成功制备了3株抗PD-1纳米抗体B7、H5和H12。并且3种纳米抗体的可溶性表达量都很高,均达到50 mg/L左右。3.抗PD-1纳米抗体的抗原结合和稳定性初步分析通过间接ELISA检测纯化后3株纳米抗体与PD-1蛋白的结合活性、通过非竞争ELISA方法测定纳米抗体与PD-1蛋白的结合数据,利用数据处理软件Excel、Graphpad prism 5等绘制曲线,模拟生成曲线公式后计算亲和力常数K_A。ELISA的方法分别测定温度、酸、蛋白酶等处理后纳米抗体的活性大小,进而评估3株纳米抗体的热稳定性、酸稳定性、蛋白酶水解稳定性及储存稳定性。研究结果表明,筛选出的3株纳米抗体具有良好的抗原结合活性,且存在较强的浓度依赖性。3株纳米抗体的亲和力均较高,B7、H5和H12抗体的亲和常数分别为:K_A=1.19×10~111 L/mol、K_A=1.63×10~111 L/mol和K_A=1.59×10~111 L/mol。在稳定性的测定中,3株纳米抗体的热稳定性均较高,在80℃高温下水浴2 h仍能保留一半以上的活性;3种纳米抗体中,纳米抗体B7和H5的酸稳定性最好,其在pH2.0的条件下仍能保有较好的结合活性,甚至不逊于pH7.0条件下的结合活性,这一特性在后续的胃蛋白酶水解稳定性测定中得到进一步的印证。在胃蛋白酶的水解实验中,有缓冲液无蛋白酶的处理组结果显示:3种纳米抗体的活性与未处理对照组相比无显著差异(P>0.05),抗体的抗原结合活性基本未受影响。在储存稳定性测定中,3株纳米抗体在4℃避光处理60 d后仍具有较高的抗原结合活性,其中H5抗体在处理120 d后仍具有50%以上的抗原结合活性,储存稳定性极好。由此表明本研究筛选得到的3株抗PD-1纳米抗体的稳定性较高,具有很高的研究和应用潜质。综上所述,本研究成功构建了抗PD-1 VHH噬菌体抗体展示文库,并从此文库中筛选到了高亲和力的多株抗PD-1纳米抗体,并对这些纳米抗体进行了初步的性质鉴定。为后续抗PD-1纳米抗体的筛选以及新型PD-1靶向药物的开发和制备奠定了基础。