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背景和目的:肝纤维化（hepatic fibrosis）是慢性肝病进展的重要环节,不加以控制治疗可进展为肝硬化甚至肝癌。目前研究证实,肝纤维化形成过程中肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSC）由静止转变为活化状态发挥着非常关键的作用。因此探索HSC活化和肝纤维化进展机制的研究有着十分重要的临床意义。肝X受体（liver X receptors,LXRs）是在细胞脂质代谢中具有重要调控作用的核受体超家族成员,包含LXRα及LXRβ两个亚型,可以通过下游效应分子促进细胞内甘油三酯合成及胆固醇外排。LXRs在HSC维持静止状态中扮演重要角色,激活LXR可以抑制肝星状细胞活化,维持其静止状态。虽然已知LXRs在维持HSC静止状态中发挥重要作用,但是具体机制仍不清楚,而且LXRs激动剂同时激活LXRα及LXRβ后具有严重的肝脂肪变等不良作用,难以运用于临床肝纤维化治疗。在肝脏内,甘油三酯合成主要是由LXRα介导的,并且肝细胞主要表达LXRα。能否通过特异性激活LXRβ而抑制HSC活化并避免LXRα激活所导致肝脂肪变?这是一个值得进一步探索的科学问题。Hedgehog（Hh）信号通路是肝细胞损伤与HSC活化的关键枢纽,在肝纤维化病理过程中发挥着重要作用,可以诱导HSC发生上皮间质转化（EMT）为肌成纤维样细胞。Hh信号通路传导高度依赖胆固醇调节,胆固醇不但介导Hh信号通路配体Sonic hedgehog（Shh）与膜受体共价结合修饰影响Shh与受体细胞结合,以及Hh信号在受体细胞内的传导;胆固醇还直接通过翻译后共价修饰影响Shh活性及外泌。而LXRs作为胆固醇调节重要枢纽,促进细胞内胆固醇外排,维持细胞内外胆固醇平衡。并且近年来研究表明,在多种肿瘤中LXRs可以抑制Hh信号通路,但具体机制不清楚。因此我们推断在HSC中,LXRs可能通过抑制Hh信号通路调控HSC活化。鉴于此,本课题首先探讨LXRβ在维持HSC静止状态中的作用;在此基础上通过激活CCl4肝纤维化小鼠模型中肝脏的LXRβ,观察小鼠肝脏病理学特征以及Hh信号通路改变;最后我们进一步探讨Hh信号通路是否参与了LXRβ调控肝星状细胞活化,并初步研究其潜在机制。方法:一、LXRβ在维持小鼠原代肝星状细胞静止状态中的作用1、小鼠原代肝星状细胞体外活化过程中LXRs及其下游效应分子表达变化提取小鼠原代肝星状细胞,分别于0、24、72、120、168h采用qRT-PCR及24、72、120、168h采用Western-blot检测肝星状细胞活化指标α-平滑肌动蛋白（Acta2）、胶原蛋白I（Collagen I）,LXRs两个亚基LXRα、LXRβ及其下游主要效应分子固醇反应原件结合蛋白1c（Srebp-1c）、三磷酸腺苷结合盒转运体A1（Abca1）表达。2、LXRβ对体外小鼠原代肝星状细胞活化的影响提取小鼠原代肝星状细胞提取,于72hLXRs激动剂T0901317及拮抗剂SR9238处理细胞,观察LXRs主要效应分子Srebp-1c、Abca1,肝星状细胞活化指标Acta2、Collagen I表达;提取同只小鼠原代肝星状细胞及肝细胞,于24h分别检测其内源性LXRα、LXRβ表达水平;于72h采用小干扰RNA（siRNA）分别干扰LXRα、LXRβ,qRT-PCR及Western-blot检测LXRα、LXRβ及其下游主要效应分子Srebp-1c、Abca1,肝星状细胞活化指标Acta2、Collagen I表达水平。3、特异性激活LXRβ对CCl4诱导小鼠肝脏组织结构的影响将小鼠分为空白对照组（control velicle）、空载腺病毒组（Ad-control+CCl4）、LXRs激动剂组（T0901317+CCl4）和LXRβ腺病毒过表达组（Ad-LXRβ+CCl4）,采用小鼠腹腔注射CCl4构建慢性肝损伤肝纤维化模型。对各组小鼠肝脏进行H&E、Masson、天狼猩红染色,观察小鼠肝脏病理学改变。4、LXRβ过表达对CCl4诱导小鼠肝星状细胞的影响通过Acta2免疫组化染色观察LXRβ过表达对活化肝星状细胞数目影响。5、LXRβ过表达对小鼠肝脏LXRs下游蛋白的影响Western-blot检测LXRα、LXRβ及其下游主要效应分子Srebp-1c、Abca1蛋白表达水平。二、LXRβ在小鼠原代肝星状细胞中对Hh信号通路的影响1、LXRβ对小鼠CCl4肝纤维化模型中Hh信号通路的影响在小鼠CCl4肝纤维化模型中检测空白对照组、空载组、LXRβ过表达组中Hh信号通路表达情况。2、Hh信号通路对体外小鼠原代肝星状细胞活化的影响提取小鼠原代肝星状细胞后,分别于0、24、72、120、168h采用qRT-PCR及24、72、120、168h采用Western-blot检测Hh信号通路Patch（Ptch）及Gli家族锌指蛋白2（Gli2）表达水平改变;采用Hh信号通路激动剂Purmorphamine及拮抗剂GDC0449刺激细胞后,观察肝星状细胞活化指标Acta2、Collagen I表达水平改变。3、LXRβ对体外小鼠原代肝星状细胞中Hh信号通路的影响采用siRNA-LXRβ干扰或Ad-LXRβ过表达LXRβ后,western blot检测Hh信号通路Ptch、Gli2,肝星状细胞活化指标Acta2、Collagen I表达水平;采用Purmorphamine、GDC0449、Purmorphamine+Ad-LXRβ、GDC0449+siRNA-LXRβ处理小鼠原代肝星状细胞,western blot检测Hh信号通路Ptch、Gli2,Hh配体Snoic Hedgehog（Shh）,肝星状细胞活化指标Acta2、Collagen I表达水平。结果:一、LXRβ在维持小鼠原代肝星状细胞静止状态中的作用1、小鼠原代肝星状细胞体外活化过程中LXRs及其下游效应分子表达变化:随着肝星状细胞体外培养活化过程,LXRα、LXRβ、Srebp-1c、Abca1表达水平逐渐下调。2、LXRβ对体外小鼠原代肝星状细胞活化的影响:qRT-PCR结果显示T0901317可以明显上调LXRs主要效应分子Srebp-1c、Abca1表达水平,抑制肝星状细胞活化指标Acta2、Collagen I表达;相反SR9238刺激细胞后,Srebp-1c、Abca1表达水平明显下调,Acta2、Collagen I表达明显增加。肝星状细胞中LXRβ亚基表达占主导地位,而在肝细胞中LXRα亚基表达占主导地位。干扰LXRα后LXRs主要效应分子Srebp-1c、Abca1,肝星状细胞活化指标Acta2、Collagen I表达水平无明显改变;而干扰LXRβ后Srebp-1c、Abca1表达明显下调,Acta2、Collagen I表达明显上调。3、特异性激活LXRβ对CCl4诱导小鼠肝脏组织结构的影响H&E、天狼猩红、Masson染色结果表明空载腺病毒组小鼠在CCl4腹腔注射5W后肝脏出现明显纤维组织增生,胶原沉积增多;LXRs激动剂组一定程度减少了纤维形成,但同时出现肝脂肪变性;LXRβ腺病毒过表达组纤维组织减少,并且未出现肝脂肪变性。4、LXRβ过表达对CCl4诱导小鼠活化肝星状细胞的影响Acta2免疫组化染色结果提示,与Ad-control相比较,过表达LXRβ后可以明显降低CCl4诱导后肝组织中的活化肝星状细胞数量。5、LXRβ过表达对小鼠肝脏LXRs下游蛋白的影响Srebp-1c及Abca1表达水平在LXRs激动剂T0901317组明显增加,;而在LXRβ过表达组,表达水平无明显增加。二、LXRβ在小鼠原代肝星状细胞中对Hh信号通路的影响1、LXRβ对CCl4肝纤维化小鼠模型中Hh信号通路的影响免疫荧光双染结果提示Gli2核表达于活化的肝星状细胞中,与空白对照组相比较,空载腺病毒组中表达明显增多;而LXRβ腺病毒过表达组中Gli2阳性细胞数较空载腺病毒组明显减少。Western-blot结果显示,与空白对照组相比较,空载腺病毒组中Gli2蛋白表达明显增加,同时Acta2、Collagen I蛋白表达明显增多;而LXRβ过表达组中Gli2蛋白表达较空载腺病毒组明显减少,Acta2、Collagen I蛋白表达也明显降低。2、Hh信号通路对体外小鼠原代肝星状细胞活化的影响Patch、Gli2表达随着小鼠原代肝星状细胞体外培养时间延长而增加;Purmorphamine刺激小鼠肝星状细胞后明显上调Acta2、Collagen I表达水平,而GDC0449明显下调Acta2、Collagen I表达水平。3、LXRβ对体外小鼠原代肝星状细胞中Hh信号通路的影响Western-blot结果显示,干扰LXRβ后,Patch、Gli2、Acta2、Collagen I表达水平明显上调;过表达LXRβ后Patch、Gli2、Acta2、Collagen I表达水平明显下调。过表达LXRβ表达的基础上联合运用Purmorphamine,与Purmorphamine单独刺激相比,过表达LXRβ对Gli2和Ptch表达水平无明显影响,但明显阻断了Purmorphamine对Hh配体Shh的上调作用,并一定程度抑制肝星状细胞活化;干扰LXRβ表达的基础上联合运用GDC0449,与GDC0449单独刺激相比,干扰LXRβ难以解除GDC0449对Hh信号通路的抑制作用,但少量增加了肝星状细胞活化程度。结论:LXRβ亚基在肝星状细胞中占主导地位,并且是维持肝星状细胞静止状态的关键分子。LXRβ激活可以抑制肝星状细胞活化,延缓肝纤维化进展,并且可以避免肝细胞脂肪变不良作用。Hh信号通路参与LXRβ调控肝星状细胞活化,并且LXRβ可能通过抑制Hh信号通路配体Shh表达从而抑制Hh信号通路。