毛细管电泳分离油松种子及针叶蛋白质的技术初探

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油松是我国北方地区主要造林树种,其木材富含松脂,耐腐,适作建筑、家具、枕木、矿柱、电杆、人造纤维等用材,亦可采松脂供工业用。研究其发育机制有很重要的意义。毛细管电泳作为一项较新的分离技术以其高通量、高灵敏度、快捷低耗、高自控化的优势弥补了传统双向凝胶电泳的不足。本文首先以6种标准蛋白为材料在已有的研究成果上进一步优化毛细管电泳分离蛋白质的条件,结果表明以下条件可以较好的分离六种标准蛋白:50μm内径的石英毛细管,柱长为50cm/58cm(有效长度/柱长),30kV分离电压,25℃电泳温度,50mbar进样5s,电泳缓冲液为50mmol,pH 2.5的磷酸盐缓冲液(内含0.05%羟乙基纤维素),检测波长191nm。将摸索好的毛细管电泳条件用于分离油松种子萌发过程中蛋白质发现蛋白质的提取方法对分离效果影响很大,在进行了三组对比三次重复实验之后确定了较为合适的提取油松种子蛋白质的方法——TCA-丙酮法,此法克服了在单位质量的植物组织中蛋白质提取量低的问题,保留了许多低丰度蛋白质,更适合毛细管电泳样品的制备。用毛细管电泳技术对油松干种子、萌发3d、6d的种子蛋白质进行分离,结果表明,该技术可检测出蛋白质随种子萌发的变化。从毛细管电泳图谱中可以看出干种子、萌发初期和萌发后期的蛋白质组分着较大的差异,干种子中保留时间约为6min的1#蛋白质在萌发3d时含量下调,在萌发6d时又上调至与干种子一样的水平;干种子中7#,8#,9#蛋白质在萌发过程中逐渐下调,在萌发6d时已经消失不见;干种子中14#,18#,19#蛋白质,在萌发过程中逐渐下调,在萌发6d时尚有十分可观的表达量;干种子中26#蛋白质在萌发3d时含量基本不变,但是在萌发6d的种子中消失;在萌发6d时逐渐产生了一些保留时间在16min-28min的低丰度蛋白质——20#,21#,22#蛋白,这在萌发6d种子和干种子的电泳图对比中可以很明显看出。用分离油松种子的方法和条件对雌性可育和雌性不育油松针叶的蛋白质进行了分离,结果表明该技术可以较好分离油松针叶蛋白质,但是分离结果的稳定性和分辨率还有待于进一步提高。由于之前的蛋白质提取条件是针对种子所优化的,若想继续研究这个问题,可再次优化针对针叶的蛋白质提取条件,或者可进行双向电泳分析,进行更细致的分析,找出差异蛋白。若进一步优化条件后仍没有改善,则推断雌性可育性的不同并没有表现在油松针叶上,可以认为雌性不育植株应该是生殖器官特异性变异。
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