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奶牛乳房炎是影响我国奶牛养殖业发展的主要疾病之一。近年来,关于奶牛乳房炎在细胞水平的研究逐渐受到人们的重视,奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,b MEC)是奶牛乳腺免疫的重要组成部分,也是研究奶牛乳房炎发病机理和筛选有效治疗药物的重要材料。植物精油是从植物中萃取而来的芳香物质,其分子量小,渗透性强,可被机体迅速吸收,研究发现其对奶牛乳房炎多种致病菌有良好的抑菌、杀菌效果。本研究通过b MEC的原代培养,获得纯化的b MEC;通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导,建立b MEC炎症模型;通过上皮细胞活力和形态学比较,分析植物精油对LPS诱导b MEC炎性损伤的影响,以及NF-κB信号通路中关键因子的表达,旨在探究植物精油对LPS诱导的b MEC炎性损伤的保护作用,为有效治疗奶牛乳房炎药物的筛选提供理论依据。1.奶牛乳腺上皮细胞的分离培养利用组织块法和酶消化法从无泌乳史奶牛乳腺组织中成功分离到了b MEC,具有b MEC的典型形态学特征,可表达上皮细胞特异性骨架蛋白-角蛋白18(CK-18)。在第2~8 d时生长曲线呈S型,表明细胞生长状态良好;10代以内的b MEC极化细胞少,传至20代后极化细胞显著增多。2.乳腺组织的冻存-80℃下在冻存液A(FBS:DMSO:DMEM/F12=7:2:1)和冻存液B(FBS:DMEM/F12:DMSO:HEPES/丙酮酸钠贮存液=10:7:2:1)中,分别快速冻存奶牛乳腺组织块(4~5 mm3),随后转移至液氮中保存。8个月后复苏乳腺组织,结果显示冻存液A中组织块成活率为50%,冻存液B中组织块成活率为56%。3.b MEC炎症模型的建立用基础培养基将LPS配制成0μg/m L、10μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L 5种不同浓度,分别作用于b MEC 12 h,细胞活力检测OD值分别为0.62±0.05、0.61±0.09、0.46±0.06、0.31±0.07、0.02±0.01,表明随着LPS浓度的增大,细胞活力呈下降趋势。再分别用0μg/m L、10μg/m L、25μg/m L、50μg/m L、100μg/m L5种浓度的LPS分别作用于b MEC 12 h,细胞形态学观察和β-防御素、IL-1β、IL-8、TNFα基因表达检测结果表明,50μg/m L的LPS对细胞形态损伤较小,能显著上调炎性细胞因子表达量。本试验选用50μg/m L的LPS处理细胞12 h,建立炎症模型。4.四种植物精油对b MEC炎性损伤的影响分别用不同体积分数的香精油、茶树油、香樟油和桉树油处理b MEC 12 h,细胞活力测定与形态学观察结果显示,百里香精油、茶树油、香樟油和桉树油安全作用剂量(体积分数)分别为0.02%、0.04%、0.04%、0.03%。荧光定量PCR分析结果表明,0.01%的百里香精油、0.04%的茶树油、0.03%的香樟油和0.02%的桉树油能显著下调β-防御素、IL-1β、IL-8、TNFα以及NF-κB信号通路中的关键因子TRAF6、Bp65、Bp50的表达。综上所述,无泌乳史的育成奶牛乳腺组织-198℃冻存8个月,可用于分离培养bMEC;50μg/m L的LPS处理纯化的奶牛乳腺上皮细胞12 h,可用于建立b MEC炎症模型;一定浓度的百里香精油、茶树油、香樟油和桉树油有降低LPS损伤乳腺细胞的作用。