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研究背景：miRNA-200c是miRNA 200家族重要的成员之一,大量研究表明miRNA-200c可作为许多肿瘤筛查分子标志物和预后判断的重要指标,其能够抑制上皮间质转化和肿瘤侵袭转移,增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。氨甲喋呤(Methotrexate, MTX)是目前应用最广泛的抗叶酸制剂,然而应用MTX治疗极易产生获得性耐药,耐药后转移是其治疗失败的主要原因。探寻影响耐药后的肿瘤细胞迁移和侵袭能力的相关分子,以便进一步研究和掌握耐药的作用机理,作为肿瘤的攻克及控制的分子理论依据,从而为克服MTX获得性耐药后肿瘤侵袭力增加的治疗提供思路。E-cad (E-cadherin, E-cad)是一类钙依赖性跨膜糖蛋白,有研究者认为其表达或功能异常与肿瘤的发生、发展及转移密切相关,且有研究表明其受Zeste基因增强子同源物2 (Enhancer of zeste homolog 2, EZH2)调节来改变对细胞迁移及侵袭的影响。本研究以肺癌A549/MTX细胞作为研究对象,研究miRNA-200c对A549/MTX耐药细胞迁移和侵袭能力的作用,及其与EZH2/E-cad通路的相关性。目的：探讨miRNA-200c对A549/MTX耐药细胞迁移和侵袭力的作用,同时研究miRNA-200c对A549/MTX耐药细胞迁移和侵袭力的作用与EZH2/E-cad信号通路之间的关系。方法：通过药物浓度逐渐增加并结合低剂量持续诱导的方法,诱导培养获得25gM甲氨蝶呤(MTX)耐受的肺癌A549细胞系(A549/MTX),然后来分别观察诱导前与诱导后细胞形态学的改变,使用MTT方法检测A549/MTX细胞耐药指数(Resistance drug index,RI)判断耐药细胞诱导情况,选择耐药程度高的细胞作为主要研究对象,随后使用miRNA-200c前体片段和阴性片段转染A549/MTX细胞株.使用实时荧光定量PCR (Real-time fluorescence quantitative-PCR, RT-PCR)来检测miRNA-200c的表达量,从而证实转染是否成功以及转染后的miRNA-200c的表达量的变化；同时观察细胞形态学的变化,另外分别使用细胞划痕实验(Wound Healing)和细胞迁移侵袭实验(transwell)来分析转染阳性成功后的耐药细胞较转染阴性的耐药细胞的迁移与侵袭能力的变化；同时通过实时荧光定量PCR方法来了解转染成功后EZH2和E-钙黏蛋白基因表达水平的变化,探讨miRNA 200c对A549/MTX细胞迁移和侵袭力产生影响的信号通路与EZH2/E-cad信号通路之间的相关性。结果：经过诱导得到25μM MTX耐药的A549细胞的耐药指数为15.7,为高度耐药。通过转染试剂盒转染细胞,将25μM MTX高度耐药的A549细胞转染miRNA 200c的前体片段后的A549/MTX细胞的miRNA-200c的表达水平比转染阴性片段的同种耐药细胞的miRNA 20Gc表达量明显升高,高出约7.2倍,差异具有统计学意义(P<0.05),间接说明转染是成功的。诱导耐药后及转染后较敏感细胞A549细胞细胞形态均发生变化。细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,经miRNA-200c前体片段转染成功的A549/MTX细胞的迁移和侵袭力较转染阴性的A549/MTX细胞出现了显著的降低现象,差异明显(P<0.05)具有统计学意义。RT-PCR检测EZH2和E-cad表达水平的结果显示,与转染阴性组比较,miRNA-200c转染成功的A549/MTX细胞表达EZH2的水平降低,而表达E-cad的水平是升高的,两组之间差异明显,具有统计学意义(P<0.05)。结论：在体外细胞实验证实A549/MTX耐药细胞的miRNA-200c表达水平升高可以明显降低该耐药细胞的迁移和侵袭能力,其作用机制可能是通过其能够降低EZH2的表达水平和增高E-cad的表达这一通路来完成的。