受MeJA诱导的烟草糖基转移酶基因的克隆及功能分析

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糖基转移酶(GTs)是动植物中广泛存在的一类酶。植物体内的GTs 催化的糖基化反应可以改变化合物的亲水性和稳定性,调节植物激素活性,也能为植物细胞解毒,增强植物抗性等。研究GTs基因表达的激素调控具有重要的理论与实际意义。 本研究以本实验室克隆的一个受甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)双重诱导的一个新的GT基因为材料,使用双元载体pCAMBIA1301,分别构建了含该GT基因全序列的重组质粒pR-GT和含GT基因启动子与GUS 报告基因编码序列融合的融合基因(GT::GUS)重组质粒pCAP-GUS。重组质粒转化大肠杆菌DH5α和LBA4404和EHA105,从筛选出的重组子中分离pR-GT 质粒DNA和pCAP-GUS质粒DNA,经酶切、PCR 扩增及测序验证,成功获得了可用于遗传转化的含目的基因的工程菌株。 以构建的工程菌株为材料,采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草W38,获得了转GT基因和转GT 启动子与GUS 报告基因编码序列融合的融合基因(GT::GUS)的转基因烟草植株。分别抽提转基因植株叶片总DNA,以未经转化的烟草W38 总DNA为对照,用目标基因特异引物PCR 扩增检测鉴定,结果表明目的基因平均转化效率为8.4%。实验中观察到,除其它的标准的转化条件外,生根诱导时选择0.2 mg L-1奈乙酸(NAA)的1/2 MS 培养基,更有利于提高转基因烟草的成苗率。 取含GT基因启动子与GUS 报告基因编码序列融合基因(GT::GUS)的转基因烟草植株幼嫩叶片进行GUS 活性染色,观察到其叶片叶缘及叶脉均呈蓝色,其中主脉染色最为明显。说明该启动子能驱动GUS基因在幼嫩叶片的这些部位的表达。在转基因成株烟草中,尽管能从基因组中检测到整合基因的存在,但实验未能检出GUS基因在转基因成株烟草叶片中的表达。出现这一现象是基因沉默还是该启动子驱动的基因表达具有时空的差异性值得进一步研究。
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