荔枝转基因胚性愈伤组织原生质体高频率再生

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本研究以采用基因枪转化法,将外源htp和gus(uid A)基因转入荔枝(Litchi chinensis Soon.)晚熟优良品种‘下番枝’,并经筛选得到的11个荔枝转基因抗性胚性愈伤组织(Transgenic resistant embryogenic calli,TREC)细胞系为材料,进行荔枝转基因抗性胚性愈伤组织长期继代保持系统的优化及其gus检测:选择其中的5个转基因抗性细胞系(Q811、Q81.535,Q9221、Q9223和Q1016)进行原生质体分离和高频率再生培养;采用转基因原生质体来源的愈伤组织进行体胚诱导,并再生转基因植株。主要研究结果如下: 1.荔枝转基因抗性胚性愈伤组织长期继代保持系统的优化。采用交替培养基培养荔枝转基因抗性胚性愈伤组织,继代2年,转基因抗性胚性愈伤组织仍然保持旺盛生长而且GUS表达量稳定。适合的交替培养基为附加1.0 mg·L-12,4—D的MS培养基和附加1.0 mg·L-12,4—D+50 mg·L-1潮霉素的MS培养基。 2.荔枝转基因抗性胚性愈伤组织的GUS检测。荔枝转基因抗性胚性愈伤组织长期继代保持过程中的GUS组织化学检测结果是:抗性细胞系Q811、Q81.535为大量稳定表达GUS类型;Q9221、Q9223为嵌合表达GUS类型;Q1016、Q6L61、Q6L161、Q42—1、Q42—2、N31、N21则为稳定不表达GUS类型。 3.荔枝转基因抗性胚性愈伤组织原生质体分离条件的优化。荔枝转基因抗性胚性愈伤组织Q811抗性细胞系原生质体分离条件的适宜条件是:转基因抗性胚性愈伤组织培养16—18 d后,转入含0.8%纤维素酶Cellulose R-10和0.4%离析酶Macrease R-10的CPW-13M酶液中,在(25±2)℃,黑暗条件下,连续振荡(30—40 r·min-1)10—11 h进行酶解。在最适条件下,荔枝转基因原生质体产量达到1.82×107个/g,活力达97.5%。 4.荔枝转基因胚性愈伤组织原生质体高频率再生体系的建立。以M12(修改的MS附加1.0 mg·L1-2,4—D+0.2 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1BA+0.2 mg·L-1KT+250 mg·L-1谷氨酰胺+50 ml·L-1CW(椰乳)+0.45 M葡萄糖和0.1 M蔗糖)为培养基,培养密度为3.0×105个/mL,采用海藻酸盐包埋悬浮方式进行暗培养,荔枝转基因原生质体的分裂频率可高达18.78%,植板率达22.30%,小克隆形成频率达3.24%。 5.荔枝转基因原生质体再生愈伤组织的GUS检测。转基因原生质体来源的5个愈伤组织抗性细胞系中:抗性细胞系PQ811、PQ81.535为大量稳定表达GUS
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