质外体是植物细胞的重要结构。质外体蛋白参与了植物的生长发育、形态建成、细胞的分裂和增殖、细胞识别和信号转导等一系列生理过程。研究表明,悬浮培养细胞中存在一些条件培养因子,能够负责早期细胞增殖分裂活性。本论文主要利用差异蛋白质组学的方法从水稻悬浮细胞的胞外介质中找寻与细胞生长和增殖有关的质外体蛋白,并对其功能进行进一步研究。首先以水稻日本晴种子为材料,建立了生长状态良好的水稻悬浮系。通过对悬浮细胞生长曲线的观察,确定分别提取培养第三天、六天和九天的悬浮细胞胞外介质蛋白。通过测定细胞内苹果酸脱氢酶活性和免疫印迹检测微管蛋白的表达来评估所提取蛋白样品中胞内蛋白的污染程度,结果表明均不含有细胞内蛋白的污染。进一步研究所提取的胞外介质蛋白对悬浮细胞的生长作用,表明第三天胞外介质蛋白明显的促进了悬浮细胞生长量的增加,而第六天和九天的胞外介质蛋白无作用。使用双向电泳分离了具有不同功能的第三天和六天的胞外介质的差异表达蛋白,发现第三天和六天的蛋白样品中具有明显的差异,共检测出十一个表达量发生变化的蛋白点,其中十个点质谱鉴定得到阳性结果,分别属于七种蛋白。生物信息学分析表明,这七个蛋白均具有信号肽,可能为分泌蛋白。通过亚细胞定位对其中三个蛋白:半胱氨酸蛋白酶（OsCP）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂（OsCPI）和碱性分泌蛋白（OsBSP）进行分析表明,OsCPI和OsBSP可以定位于细胞壁上,OsCP呈泡状分布。同时利用实时定量PCR检测OsCP、OsCPI和OsBSP在不同培养天数的悬浮细胞的转录水平表达情况表明,OsCPI和OsBSP的RNA变化趋势与蛋白变化趋势相一致,而OsCP的RNA变化趋势与其蛋白变化趋势相反,可能由于翻译后修饰造成。另外为了更加了解水稻悬浮细胞胞外介质蛋白的组分,我们通过单向电泳和LC/MS-MS联用,对第三天胞外介质蛋白进行鉴定,结果得到α-amylase、过氧化物酶等一些已知的质外体蛋白。在双向电泳检测出的差异蛋白中,OsCP是在第三天胞外蛋白中表达量高,此样品能够促进悬浮细胞增殖。OsCPI在第六天胞外蛋白中检测出,而三天蛋白中未见其表达。这一有趣的现象引起我们的关注,因此对于OsCP和OsCPI在悬浮细胞中的作用,进行了进一步的研究。通过构建OsCP RNAi的双元载体,遗传转化水稻愈伤组织,最终建立3个转基因水稻的悬浮系。Sourthern-blot分析表明3个悬浮系均为不同T-DNA插入的株系。实时定量PCR分析表明3个悬浮系中OsCP的表达量均下降。对3个OsCP RNAi的悬浮系的鲜重和干重的增长率统计显示,与空载体对照相比,其增长率均下降。细胞直径测量统计分析表明,悬浮细胞的大小并未受到影响。同时纯化OsCPI融合GST标签的重组蛋白,蛋白活性检测表明纯化蛋白可以抑制木瓜蛋白酶的活性。将10-7、10-8 M的OsCPI外加到野生型的悬浮培养基中,发现其蛋白抑制了水稻悬浮细胞的生长,并且抑制作用具有剂量依赖性,而且同时影响了水稻悬浮细胞的状态和降低细胞外蛋白酶的活性。10-7 M的OsCPI加入到烟草BY-2悬浮细胞中并未影响其细胞的生长,表明OsCPI对悬浮细胞生长的抑制作用具有物种特异性。以上研究利用双向电泳和质谱分析等技术手段,对可能影响水稻悬浮细胞生长的质外体蛋白进行鉴定,对其中两个蛋白半胱氨酸蛋白酶（OsCP）和半胱氨酸蛋白酶抑制剂（OsCPI）进行后续的研究。结果表明蛋白酶和抑制剂作为细胞外蛋白,可能参与了水稻悬浮细胞生长的调节过程。