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甘露糖结合凝集素(mannose- binding lectin, MBL)是一种由肝脏合成和分泌的急性期蛋白,属于胶原凝集素家族,广泛存在于肝脏及血液中。MBL通过激活补体和调理吞噬作用在抗感染的起始阶段起主导作用,是一种重要的天然免疫防御分子。本试验从羊MBL基因序列入手,结合绵羊肺炎支原体感染情况,探讨MBL基因启动子区甲基化与绵羊支原体肺炎的相关性,为进一步诊断与治疗绵羊支原体性肺炎的提供重要的理论依据,为优良品种的选育提供科学参考。一、绵羊MBL基因启动子区的克隆及序列分析为了得到绵羊MBL基因启动子区序列,本研究参照本实验室向NCBI提交的绵羊MBL基因序列(GenBank:FJ977629.1),设计3对特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,采用TAIL-PCR技术扩增得到一特异性片段,经回收重组到pMD18-T载体,筛选阳性克隆,测序。结果如下：所测序列长为679 bp,并通过生物软件和权威在线预测网站对其结构进行分析比对,发现所获得序列内含DEF、Ets、GAGA-1、TCF/LEF和Otc-3等多种转录调控原件和结合位点,本试验所得绵羊MBL基因启动子是1个无TATA-box但有Ets和DPE且能正常转录的真核启动子,实验成功获得了绵羊MBL基因的启动子区序列。二、绵羊MBL基因启动子区甲基化检测方法的建立表观修饰是一类高于基因水平的基因表达调控机制,DNA甲基化作为表观修饰的核心内容,一直是分子生物学研究的热点之一。DNA甲基化是脊椎动物DNA唯一的自然化学修饰,在基因表达调控等方面发挥重要作用。基因启动子区及其附近区域内CpG甲基化的程度与转录的抑制程度关系密切。本实验中,选取患支原体肺炎的绵羊4只,对肝脏组织提取DNA,根据BSP法引物设计原则设计引物,采用BSP甲基化检测技术对该基因启动子区序列进行甲基化检测。结果如下：选用BSP甲基化检测方法成功地检测了扩增出的234bp目的片段,甲基化分析发现,感染MP绵羊MBL基因启动子区中的6个CpG位点有5个为甲基化位点,而正常绵羊MBL基因启动子区中的6个CpG位点有4个发生甲基化,差异较大,证明本实验建立的BSP甲基化检测技术平台准确可靠。三、绵羊MBL基因启动子区甲基化与支原体肺炎相关性研究MBL作为人类天然免疫系统中重要的一线抗感染分子,已表明与多种疾病相关,如一般免疫缺陷、特异性感染、囊性纤维病(CF)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)等。绵羊支原体性肺炎是由绵羊肺炎支原体所引起的一种特异性感染疾病。本研究选用3月龄绵羊43只构建试验群体(攻毒组37只,对照组6只),用绵羊肺炎支原体(M.ovipneumonia)标准株Y-98对攻毒组进行气管内接种,运用BSP甲基化检测技术,成功检测了37只攻毒组绵羊及6只对照组绵羊中MBL基因启动子区甲基化及血清中MBL浓度水平情况,结果如下：(1)攻毒后,攻毒组中MBL血清水平呈降低趋势,且差异极显著(p<0.01),而对照组在统计学上未显示显著性差异；(2)所选目的片段中共6个CpG位点,对照组有2-4个甲基化位点,主要集中在CpG1、CpG2、CpG3和CpG6而位点4、5均未发生甲基化；攻毒组中有4-6个甲基化位点,比较对照组而言,CpG3、CpG4和CpG5甲基化显著(p<0.05)；(3) 6只攻毒试验中死亡的绵羊检测到甲基化并且血清水平MBL极显著(p<0.01)降低的标本中,CpG5甲基化发生率极显著(p<0.01)高于其它5个CpG检测位点,CpG3和CpG4甲基化发生率显著(p<0.05)高于剩余3个CpG位点,而CpG1和CpG2位点甲基化发生率在攻毒组和对照组间则未见有统计学意义的差异,提示MBL基因中启动子区靠近编码序列的CpG位点(CpG3、CpG4、CpG5)甲基化对于调控MBL蛋白表达可能具有更为重要的意义。