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岷山红三叶(Trifolium pretense L.cv.)是甘肃省高寒阴湿地区药草兼用型高产优质牧草。该牧草异黄酮含量为大豆异黄酮的10倍,是提取天然异黄酮的优良资源。至2015年,岷县岷山红三叶留床面积将达到6666 hm2。目前,岷县地区岷山红三叶增产、防病的传统方法是使用工业化肥和农药。这一传统生产方式导致土壤退化,土壤肥力下降,草产量下降,土壤微生物区系多样性破坏等问题。生物菌肥在其它作物中的开发利用为解决这一问题提供了新的思路和途径。利用从岷山红三叶根际(根系及根表土)分离筛选的优良促生、生防菌研发生物菌肥有可能在增产的同时实现对工业化肥、农药的部分替代或完全替代,以降低生产成本,防治土壤退化,保护土壤微生态环境。目前,适用于岷县地区岷山红三叶的促生、生防菌肥尚未见报道。本研究以岷山红三叶为研究对象,旨在从岷山红三叶根系及根表土壤分离、筛选具有固氮、溶磷、分泌IAA、拮抗病原菌能力的菌种资源,研究筛选的优良促生、生防菌株的生物学特性,并利用16S rDNA序列分析进行菌种资源的鉴定,初步探究优良促生菌的溶磷途径。通过盆栽试验研究促生、生防菌制成的生物菌肥替代部分化肥对岷山红三叶生长和品质的影响。主要研究结果如下:1.岷山红三叶根际促生菌资源特征、促生特性存在很大差异岷山红三叶根际分离出12株根瘤菌,在YMA(酵母甘露醇琼脂)培养基上生长速度较慢,其固氮酶活性在0.42~4.88μmo L C2H4/mL?h之间。固氮酶活性大于2.00μmo L C2H4/mL?h的有5株,固氮酶活性最强的是MHSG8,MHSG8固氮酶活性显著高于其他菌株(P<0.05)。筛选出分泌IAA菌株20株,在King培养基上生长状况较好。分泌IAA能力较强的菌株有5株,分泌IAA量在9.35~12.01μg/mL之间。菌株MHS19 IAA分泌量最大,且显著高于其他菌株(P<0.05)。筛选出溶磷菌26株,溶磷能力较好的菌株有6株,溶磷量在50.34~269.50 mg/L之间。溶磷能力大于150 mg/L的有4株。MHS30溶磷能力显著高于其他溶磷菌株,溶磷量达到269.50 mg/L(P<0.05)。剔除酵母膏和FeSO4?7H2O的PKOC2培养基比PKO、PKOC1培养基更适合筛选根际溶磷菌。葡萄糖、MgCl2?6H2O、(NH4)2SO4是影响溶磷菌溶磷能力的关键因子,最适宜添加量分别为18.19 g、3.21 g、0.08 g。2.筛选出具有较好促生特性的菌株通过评价供试菌株固氮酶活性,溶磷能力、分泌IAA及拮抗病原菌能力发现,菌株MHSG8固氮酶活性较高(4.88μmoL C2H4/mL?h);菌株MHS7、MHS27、MHS30和MHS49溶解磷酸钙能力较强(153.00~269.50 mg/L);菌株MHS19、MHS13分泌IAA量较大(11.65~12.01μg/mL),菌株MHS7、MHS27、MHS31、MHS48可以拮抗3种病原真菌(Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum、Fusarium oxysporum f.niveum)。上述菌株具有良好的促生、生防性能,具备研制根际生物菌肥的潜力。3.鉴定了优良促生菌从岷山红三叶根际分离筛选出7株优良促生菌。经形态学、生理生化及16S rDNA鉴定,优良促生菌分属Bacillus subtilis(3株)、Pseudomonas fluorescens(1株)、Klebsiella oxytoca(1株)、Bacillus cereus(1株)、Bacillus pumilus(1株)。4.促生菌溶磷途径存在差异菌株MHS49主要是通过分泌柠檬酸和丁二酸溶解无机磷;菌株MHS30主要通过分泌柠檬酸、酒石酸、甲酸溶解无机磷。菌株MHS7与MHS27的溶磷途径与上述两种溶磷菌不同,存在其它溶磷途径。5.岷山红三叶根际存在生防菌种资源,可有效拮抗部分病原菌筛选出4株优良生防菌MHS7、MHS27、MHS31和MHS48。MHS7、MHS27和MHS31分属Bacillus subtilis、Bacillus thuringiensis和Pseudomona fluorescen。MHS7、MHS48对Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum有抑制作用,抑菌率分别为73.8%、41.8%,MHS27、MHS31对Rhizoctonia solani抑菌率分别为64.3%、71.2%,对Fusarium oxysporum f.niveum抑菌率分别为81.7%、64.5%。对有拮抗能力的生防菌进行产铁载体定性、定量测定发现,菌株分泌铁载体量由大到小依次为:MHS27>MHS31>MHS7>MHS48。6.利用筛选出的优良菌株研制出具有促生、防病的岷山红三叶复合菌肥筛选出的促生、生防菌可在岷山红三叶根际成功定植。研制的生物菌肥符合《微生物肥料》标准(NY227-94)。使用该菌肥可减少25%化肥,同时可较好地促进岷山红三叶生长,干草产量提高4.76%,粗蛋白、粗灰分及钙含量分别提高11.41%,0.42%,13.33%;中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量分别降低7.55%,7.54%;但当生物菌肥替代50%化肥,对4种异黄酮(大豆黄素、染料木黄酮、刺芒柄花素、鹰嘴豆芽素A)的含量没有造成显著影响,对产量、品质影响不显著。