核盘菌(Scletotinia sclerotiorum)是引起油菜菌核病的病原菌。由于缺乏高抗品种,防治通常依靠专一位点的内吸性杀菌剂。二甲酰亚胺类杀菌剂(DCF)菌核净属于杀菌剂抗性行动委员会(FRAC)的E3组杀菌剂,其干扰渗透信号转导,在中国使用已超过12年。虽然目前报道的田间抗性频率较低,但杀菌剂大量使用可导致核盘菌抗药性频率升高。本研究使用一株田间抗性菌株和35株实验室突变体,探索未知的菌核净抗性机理。首先,检测了四株抗性菌株/突变体的杀菌剂交互抗性,不同的适合度参数,如EC50值、菌丝生长速率、菌核产量、致病性、渗透压、氧化应激、电解质检测,以及分子生物学研究。通过EC50值的测定,明确了核盘菌对菌核净和腐霉利、异菌脲及咯菌腈之间存在交互抗性。与敏感菌株相比,抗性菌株/突变体的菌丝生长速率减小,在油菜叶片上的致病力降低,对渗透压和氧化应激更敏感,以及释放更多的电解质。就菌核产量而言,抗性菌株/突变体和敏感之间没有显着差异。分子检测发现一株突变体的高渗透压甘油信号转导途径(HOG)的SsOs1基因上存在点突变(V238A)。该基因在田间抗性菌株HN456-1-JBJ中没有表达,在经高渗透压或菌核净处理的菌丝中表达量降低。HOG途径的另一个关键基因SsHog1,在NaCl处理的抗性菌株和突变体中诱导表达。其次,用cDNA文库转化技术筛选菌核净抗性相关基因。我们构建了菌核净抗性菌株HN456-1-JBJ的cDNA文库,并通过农杆菌介导转化到敏感菌株HN404-2-J中。通过一系列的转化,没有cDNA片段插入到敏感菌株中,只有两个转化子证实含有空载体,其他30个抗性转化子不包含任何外源插入,并被视为在cDNA文库转化和杀菌剂筛选中引起的自然突变。与亲本菌株HN404-2-J相比,30株菌核净抗性突变体的EC50值明显升高。在不含菌核净的PDA上培养10代后,突变体的抗性仍然稳定。为了调查菌核净抗性的分子机理,通过实时PCR,检测了突变体的SsOs1基因表达。结果表明,19株突变体表达了SsOs1基因,但有趣的是,11株突变体并没有表达该基因。比对19株表达SsOs1基因的抗性突变体和亲本敏感菌株的SsOs1基因核苷酸序列,发现14株突变体在不同的位点含有点突变;一株突变体(P-3-3)在两个独立的位点322和406含有点突变;两株突变体(P-3-26和P-3-8)分别在氨基酸位点279和553变成了终止子;一株突变体(P-3-20)在位点542-544之间插入了3个氨基酸;最后一株突变体(No.As-2nd-17)在位点657-663之间缺失了7个氨基酸。本研究对抗性菌株环境适合度的测定,包括菌丝生长速率,离体菌核产量,致病力,渗透和H2O2的敏感性,表明与敏感菌株相比,在没有杀菌剂选择压力的田间,抗性菌株可能无法有效竞争。SsOs1基因不表达或非特异性的点突变可能赋予了核盘菌对DCF类杀菌剂的抗性。