本研究主要介绍硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达，并对其酶学特性进行分析。论文共包括五部分试验：(1)硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因全长cDNA的克隆及其序列分析。利用RT-PCR和RACE技术获得硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因全长cDNA序列，全长1345 bp，具有-1152 bp的开放阅读框，编码384个氨基酸，分子量约为41 kDa，通过序列比对分析，结果表明，与所报道的真菌来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列同源性最高为72.2％，属于糖苷水解酶家族5。该序列在GenBank上的登录号为DQ328335。(2)β-甘露聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化和特性研究。克隆β-甘露聚糖酶基因成熟蛋白编码序列到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上，重组质粒命名为pET-28a(+)-mann，化学法转化E coli BL21宿主菌，经1 mmol/L IPTG诱导，经SDS-PAGE电泳结果表明，表达蛋白的分子量为43 kDa。表达产物经镍亲和层析柱纯化并经变性复性处理后，表达蛋白酶活力为5.2 U/mL，表达量为25 mg/L，重组β-甘露聚糖酶的等电点为4.89。酶学性质分析表明，最适反应温度为50℃，最适pH值为2.4，在pH 2.4-8.0和40℃以下具有很好的稳定性。Western-blot分析结果表明，表达出的β-甘露聚糖酶具有很好的抗体特异性。(3)硫色曲霉β-甘露聚糖酶E206和E314定点突变分析。利用重叠延伸PCR法扩增含突变的酶基因序列，克隆到pET-28a(+)载体上，化学法转化E.coli Top10。筛选阳性克隆，导入E.coli BL21宿主菌，经IPTG诱导，表达产物经镍亲和层析柱纯化，酶活分析结果表明，突变重组酶未检测到β-甘露聚糖酶活性。这一结果表明，谷氨酸E206和E314为硫色曲霉β-甘露聚糖酶的催化氨基酸。(4)野生型β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的诱导表达研究。将目的基因序列构建到毕赤酵母表达载体pPICZoA上，重组质粒命名为pPICZαA-MANN，Sac Ⅰ线性化，电转化毕赤酵母X-33宿主菌，Zeocin抗性筛选阳性克隆。Southern-blot和PCR结果表明，重组子整合到毕赤酵母基因组上，并具有很好的遗传稳定性。SDS-PAGE和Westem-blot分析表明，表达产物是分子量为48 kDa的糖基化蛋白。重组菌株经甲醇诱导96 h后，β-甘露聚糖酶活性和表达量最高，分别为96 U/mL和262 mg/L，蛋白纯度达97％以上。酶学特性分析表明，所表达的β-甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖具有高度的特异性，最适pH为2.4，最适温度为50℃，在pH 2.2-8.0和温度低于40℃时稳定，且β-甘露聚糖酶活力不受金属离子(Ca<2+>、Cu<2+>、Mg<2+>、 Zn<2+>、Na<2+>、Fe<2+>和Mn<2+>)和EDTA的显著影响。酶动力学参数分析结果表明，K<,m>和V<,max>分别为0.93 mg/mL和344.83 U/mg。(5)β-甘露聚糖酶基因密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达。根据毕赤酵母密码子的偏好性，人工改造硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因序列，构建到表达载体pPICZctA上，重组质粒命名为pPICZαA-MAN-1，野生型重组子作为对照。重组子经Sac Ⅰ线性化，电转化毕赤酵母X-33宿主菌，Zeocin抗性筛选阳性克隆。Southem-blot和PCR结果表明，重组子整合到毕赤酵母基因组上，并具有很好的遗传稳定性。在摇瓶水平上，密码子优化基因的重组子的酶活比野生型重组子提高32％。密码子优化基因的重组菌在10 L发酵罐中进行发酵培养，96 h甲醇诱导后，其表达水平达3 g/L，酶活达1100 U/mL，蛋白纯度达96％以上。糖基化分析和N端氨基酸序列测定结果表明，该酶为糖基化蛋白。酶学特性与转化野生型基因重组酵母的表达产物相似。K<,m>和V<,max>分别为0.86 mg/mL和357.14U/mg。这些酶学特性表明，该酶适于动物的胃肠道环境，具有开发作为饲料酶添加剂使用的前景。