日本脑炎是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种重要的脑炎疾病，主要分布在东亚和东南亚地区，每年有30000～50000人感染，引起10000～15000人死亡。JEV属于黄病毒科(Flaviviridae)的黄病毒属(Flavivirus)，由蚊子进行传播，自然界中主要在蚊子-猪和蚊子-水鸟之间进行传播。人是JEV的最终宿主，维持很低的病毒血症。在过去的二十年间，JEV已经传播到了新的地理区域，例如澳大利亚北部、巴基斯坦等地区，逐渐经成为全球关注的公共卫生问题。根据世界卫生组织(WHO)推荐，对JEV的防治主要以接种疫苗为主，但是接种疫苗并不能完全控制病毒的传播。目前为止，依然没有有效的针对JEV感染的特效药用于临床，因此，研究开发新的针对JEV感染的药物势在必行。　　病毒与细胞受体的结合对病毒感染至关重要，筛选阻断病毒与细胞表面受体结合的小分子是近年来研发抗病毒药物新的有效策略。JEV的包膜蛋白（envelope protein，E蛋白）在JEV的吸附及进入过程中发挥重要作用，特别是E蛋白结构域Ⅲ(E DⅢ)不仅是病毒与细胞受体结合的主要区域，而且E DⅢ的回折是E蛋白变构介导的病毒-细胞膜融合的主要动力，因此，封闭E DⅢ关键位点阻断病毒与细胞受体结合或阻断E蛋白变构可有效抑制JEV的感染。　　噬茵体展示肽库技术可以快速的从数百万个克隆中高通量筛选与靶标相互作用的多肽，是一种有效的、并广泛用于新型多肽类药物开发的技术。本研究通过PCR扩增得到E DⅢ序列，氨基酸同源比对分析发现扩增得到的E DⅢ与JEV强毒株E DⅢ氨基酸序列高度同源，可以作为噬菌体展示肽库的筛选靶标。采用不同的限制性内切酶位点，先后构建了两个原核表达载体pET-30a(+)-EDⅢ和pET-22b(+)-E DⅢ。表达载体pET-30a(+)-E DⅢ高效表达以包涵体形式存在的E DⅢ蛋白;而表达载体pET-22b(+)-E DⅢ在E DⅢ蛋白N端添加了定位于细菌周质空间的信号肽pelB，在22℃条件下诱导表达蛋白时，信号肽可引导E DⅢ蛋白分泌至细菌周质空间，形成可溶表达。用Ni-NTA亲和层析纯化包涵体E DⅢ和可溶的EDⅢ，得到纯度＞95％E DⅢ蛋白。用Western Blot(WB)鉴定纯化到的E DⅢ蛋白，结果显示在分子量13kDa左右有单一条带，与E DⅢ理论分子量一致，说明纯化得到的E DⅢ是正确的。将纯化的包涵体E DⅢ复性，用圆二色光谱(CD)测定复性的E DⅢ和可溶性的E DⅢ的二级结构，在232nm处有一个小的正峰，215nm附近有明显的负峰，与β折叠片的特征峰吻合，说明E DⅢ复性成功并且与与E DⅢ天然构象一致。　　分别用纯度＞95％的由包涵体复性的E DⅢ和可溶表达的E DⅢ为靶标，淘选噬菌体展示肽库，提高洗脱液中吐温-20(Tween-20)的含量增强洗脱强度。经过5轮淘选，从复性的E DⅢ淘选到的噬菌体中挑选43个阳性噬菌体，分离噬菌体DNA并测序，核酸同源性分析后发现富集到3组噬菌体，富集率分别为3/43、2/43和2/43，噬菌体展示的多肽为12肽;从可溶的E DⅢ淘选的噬菌体中挑选44个阳性噬菌体，富集到6组噬菌体，最高的富集率为13/44，噬菌体展示的多肽长短不一，多数大于12个氨基酸。将E DⅢ包被在平板上，用酶联免疫吸附试验(ELI SA)验证噬菌体与E DⅢ的结合，证明富集到的噬菌体与E DⅢ的结合是特异性的。根据噬菌体的富集率和噬菌体展示多肽的同源性分析，最终选定并化学合成高度富集和高度同源的8条多肽，用于抑制JEV感染的活性研究。　　分析多肽性质，将亲水多肽溶于磷酸缓冲液(PBS)中，疏水多肽溶于二甲基亚砜(DMSO)中。将不同浓度的多肽与JEV混合后，感染BHK-21细胞，采用噬斑减少实验、WB和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定多肽对JEV感染的抑制效率，发现命名为P3的12肽-SENRKVPFYSHS抗病毒作用最强，IC50和IC90分别为～1μM和～100μM。用分子相互作用仪测定P3与EDⅢ蛋白的结合力，发现P3可以直接与E DⅢ结合，解离平衡常数为6.06×10-6M。用分子对接软件ZDOCK模拟P3与E DⅢ的结合模型，P3通过疏水作用结合在E DⅢN端的疏水口袋中。突变E DⅢ上形成疏水口袋的关键位点(V357A)，P3与EDⅢ结合能力下降，从而证实结合模型是真实可信的。实验发现P3可以抑制JEV吸附到细胞表面，因此，我们推测P3结合在E DⅢ N端与病毒吸附相关的关键位点BC loop和DE loop附近，影响JEV与细胞受体的结合，通过阻断病毒吸附到细胞表面而抑制病毒感染。本研究有助于人们深入理解JEV E蛋白与受体结合的细节，为开发新的抗JEV药物提供先导分子，为设计广谱的黄病毒进入抑制剂提供重要参考。