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植物干细胞位于一类特殊的结构—分生组织中,而后者是植物生长及胚后发育中产生新器官的源泉。植物幼苗的生长开始于两个分生组织—即分别位于根端和茎端的初生分生组织。拟南芥中,茎端分生组织(SAM)中WUSCHEL(WUS)与CLAVATA3(CIN3)形成一个反馈调节环,参与干细胞的稳态调控;与之类似,WOX5(WIJS-RELATED HOMEOBOX5)与CLE40在根端分生组织(RAM)处也形成一个反馈调节环,通过使WOX5特异表达在静止中心(QC)来维持相邻干细胞的命运。本实验室已发表研究结果表明,ROW1(RepressorOfWUS1)可能通过限制WUS特异性表达在组织中心(OC)进而调节茎端分生组织功能。本论文研究发现,ROW1对WOX5特异表达在静止中心(Qc)同样是必须的。 row1-3完全敲除突变体在根端分生组织处表型剧烈:细胞分裂旺盛,不能进行正常的组织分化,同时根尖无淀粉粒着色且不能进行向地生长。实验表明,WUS基因在拟南芥根部几乎不表达,推测lOW1-3突变体根端的表型可能与WUS无关;对WUS所在基因家族的其他15个基因进行表达模式的分析,发现相对于野生型,只有WOX5在rOW1-3中的表达量极显著高调,提高了40多倍。遗传学实验表明,wox5-1/row1-3双突变体根部的表型与wox5-,突变体类似,其根冠处row1-3的表型基本被抑制:QC细胞与小柱细胞之间的远端干细胞发生分化,表现出“未成熟即分化”(premature differenciation)特征,同时淀粉粒较野生型多,表现出更为剧烈的向地反应。CaMV35S::ROW1植株中,由于ROW1过量表达抑制了WOX5的正常表达,使得过表达植株的根部出现了与wox5-1同样的表型。染色质免疫共沉淀实验结果显示,WOX5启动子区的P3和P4区域能够被ROWl的抗体结合并洗脱下来,也就是说ROW1可以结合至WOX5启动子区的P3和P4区段。以上实验结果表明,ROW1可能通过抑制WOX5的表达来调控根端分生组织的功能。 半薄切片结果显示,row1-3突变体的根尖未发生明显的分化,只出现了类维管束和类表皮结构,而未分化出严格的小柱细胞、侧生根冠、皮层、内皮层等结构。EdU掺入实验中,野生型植株的QC区几乎检测不到红色荧光,表明这些细胞没有EdU的掺入,显示其几乎不发生分裂;而row1-3突变体根尖则检测到强烈的红色荧光,表明这些细胞有大量EdU掺入,显示其处于旺盛的分裂中;wox5-1与wox5-1/row1-3双突变体植株的根尖Qc细胞和已经发生分化的远端干细胞均检测不到红色荧光,表明这些细胞几乎不发生分裂。在野生型植株中,WOX5启动子驱动的GFP表达局限在根端分生组织的QC处,而ROWl启动子驱动的GFP则主要表达在QC外围的干细胞以及分生区细胞中;在row1-3突变体植株中,WOX5启动子驱动的GFP的表达范围由QC扩散至周围细胞中,表明ROW1可能通过限制WOX5在QC中的特异性表达,调控根端分生组织的功能、小柱细胞的结构以及根的向地性。 对ROW1蛋白进行结构域分析发现,其中间403aa-451aa可能是一个PHD(plant homeodomain)结构域。体外表达该结构域并进行组蛋白多肽结合实验,证明该结构域能够与组蛋白H3K4.me3修饰相互作用;同时,染色质免疫共沉淀实验表明,WOX5启动子区的P3和P4区段确实含有组蛋白H3K4me3修饰。对WOX5启动子区转录起始位点处的核小体进行分析,发现row1-3中核小体的结构确实较野生型中松散。以上结果暗示,ROW1可能通过其PHD结构域与WOX5启动子区的P3和P4区段上的组蛋白H3K4me3修饰相互作用,来发挥抑制作用。