Epstein-Barr（EBV）病毒是疱疹病毒科γ亚科中唯一能引起人类感染的淋巴滤泡病毒，在人类广泛传播，约95％的成人携带EBV。越来越多的研究表明，EBV与多种人类肿瘤相关，如非洲儿童Burkitts淋巴瘤（BL）、鼻咽癌（NPC）、何杰金氏病（HD）以及免疫抑制病人和器官移植病人的淋巴细胞增生紊乱引起的淋巴瘤（PTLD）等。鼻咽癌是我国南方及东南亚地区的一种高发恶性肿瘤，发病率高达20～50／100000／年，有着明确的地理分布特征及人群特征。目前，放射治疗是鼻咽癌治疗的基本方法，早期病人的治愈率可达80％～90％，而晚期病人治疗后的5年生存率仅为10％～40％。鼻咽癌尤其是中晚期鼻咽癌治疗失败原因多是局部复发和远处转移，疾病一旦复发和转移，85％的病人在一年内死亡，其余的病人也会在三年内全部死亡。 EBV的存在为肿瘤的治疗提供了靶位。在鼻咽癌细胞中，仅表达EBNA1、LMP1（约50％NPC病例）、LMP2三种EBV蛋白。EBNA1含多个“甘氨酸和丙氨酸（Gly-Ala）”组成的重复序列，抑制蛋白酶复合体对抗原的加工和MHC-Ⅰ类分子限制的抗原递呈作用，从而逃避由杀伤性T细胞介导的细胞免疫。LMP1是癌基因，有明确的致癌作用，参与肿瘤的癌变过程。而LMP2具有不引起B淋巴细胞的转化、无致癌性、存在于细胞的表面、在鼻咽癌细胞中持续表达等特点，成为诱导EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、预防和治疗相关肿瘤的良好靶抗原。临床上应用LMP2特异性的CTL治疗EBV相关的淋巴细胞增生症，证明有良好的疗效。 腺病毒载体具有宿主范围广、安全性高、稳定性好、能诱发较强的细胞免疫以及应用方便等优点，被广泛应用到重组病毒疫苗的研究中。本课题组左建民等应用腺病毒载体系统AdEasy-1，成功构建了含有EBV-LMP2基因的重组腺病毒Ad-LMP2，并证明该病毒体外活化的CTL，可以有效抑制表达LMP2蛋白的鼻咽癌细胞系CNE-2的生长，并延缓CNE-2细胞在SCID小鼠体内的成瘤作用。在此基础上，本文对Ad-LMP2疫苗进行进一步的研究，为该疫苗的临床应用提供依据。 首先鉴定了纯化的重组腺病毒Ad-LMP2。Ad-LMP2是插入了EBV-LMP2基因的、缺失病毒E1区的非复制性5型重组腺病毒。检测结果证明LMP2基因插入位置正确、病毒感染活性良好、LMP2蛋白可以有效表达，并测定在3×10<10>个病毒颗粒中，复制型病毒（RCA）少于1个。 通过对不同贮存温度、不同保存时间重组病毒感染活性的检测，研究了温度对Ad-LMP2稳定性的影响。结果表明-70℃、-20℃保存一年、4℃保存3个月以内，重组腺病毒活性没有明显变化；而保存在25℃、37℃，病毒活性逐日下降。 本研究重点评价了Ad-LMP2以肌肉注射的方式免疫恒河猴，诱导的针对LMP2的细胞、体液免疫应答。分别使用高（4.5×10<11>VP/kg）、中（1.5×10<11>VP/kg）、低（0.5×10<11>VP/kg）不同的病毒剂量，肌肉注射恒河猴，于初次免疫后的第7周分离恢复期外周血单个核细胞（PBMCs），ELISPOT方法检测释放细胞因子IFN-γ的细胞占外周血单个核细胞的比率。结果显示，三个剂量组的猴子都可以产生针对LMP2的特异性细胞应答，诱导的细胞免疫应答水平与免疫剂量之间存在一定的依赖关系，高剂量组比低剂量组免疫后产生的细胞应答要高。其中，给予高病毒剂量免疫的恒河猴，1×10<0>个外周血单个核细胞中，经LMP2多肽刺激后释放细胞因子IFN-γ的细胞最高可达1340个。应用免疫酶法检测Ad-LMP2免疫的恒河猴血清中抗LMP2特异性抗体的滴度，结果显示不同剂量组诱导的抗体滴度也不相同，免疫的病毒量越大，产生特异性抗体的滴度相对来讲也较高，其中最高滴度可达640。 在安全性方面，小鼠急毒、恒河猴长毒、及一般药理实验均没有发现异常。利用免疫系统缺损的SCID小鼠，皮下免疫Ad-LMP2，没有肿瘤形成，表明该病毒不具有致癌性。 总之，Ad-LMP2重组腺病毒可以诱导机体产生LMP2特异性T细胞应答和抗体，并被证明是安全可靠的，因此，有可能成为鼻咽癌治疗和高危人群的预防疫苗。依据国家对生物制品注册的管理规定，对Ad-LMP2相关的研究资料进行了整理，为该疫苗申报Ⅰ期临床做好准备。