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1目的通过收集强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis,AS）患者临床数据资料进行数据挖掘分析,明确AS患者的心功能异常及与免疫炎症指标的相关性,探讨健脾化湿通络法治疗AS心功能异常患者的用药规律,探讨健脾化湿通络法治疗AS心功能异常患者的用药规律,及与超声心动图参数、实验室指标间的关联性。通过体内研究,探讨AS患者超声心动图参数、免疫炎症指标、micro RNA-23a-3p/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（miR-23a-3p/phosphoinositide3-kinase/protein kinase B/mechanistic target of rapamycin,PI3K/AKT/mTOR）信号通路指标的相关性。通过体外细胞实验,研究健脾化湿通络方-新风胶囊（XFC）,改善AS心功能的生物学机制。2方法2.1回顾性数据挖掘研究基于回顾性数据挖掘研究,筛选安徽中医药大学第一附属医院风湿科从2012年6月至2020年7月AS住院患者的病历资料及口服中药资料。分析患者实验室指标的变化及处方涉及中药的性味归经情况。运用关联规则评价中医药治疗对AS心功能异常患者免疫炎症指标的影响,二元Logistics回归分析AS心功能异常的危险因素。运用复杂网络技术分析AS心功能异常患者的核心处方,统计中药性味归经频数,采用关联规则探究中药对AS心功能异常患者免疫炎症指标、心功能参数的影响。2.2体内实验研究选取30例AS心功能异常患者为研究组,30例正常健康人为对照组,分析两组心功能参数、临床指标的变化,采用实时荧光定量（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）检测m RNA表达（包括miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR）,酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent method,ELISA）检测细胞因子的变化。2.3体外实验研究2.3.1 XFC含药血清对AS-CD4+T细胞联合滑膜成纤维细胞共培养miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响从正常人与AS心功能异常患者外周血单个核细胞（Peripheral blood monon-uclear cells,PBMCs）中分离出CD4+T细胞,并利用transwell小室与AS滑膜成纤维细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）进行共培养。采用ELISA法检测共培养小室培养液上清中白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α的表达。采用RT-qPCR法检测下室AS-FLS中miR-23a-3p、PTEN、PI3K、AKT、mTOR的表达。采用蛋白免疫印迹法（Western blotting,WB）检测下室AS-FLS中PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白的表达。2.3.2 XFC含药血清对AS-CD4+T细胞联合人正常心肌细胞（HCM）共培养miR-23a-3p/PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响从正常人与AS心功能异常患者PBMCs中分离出CD4+T细胞,并利用transwell小室与正常人的心肌细胞（HCM）进行共培养,采用ELISA法检测transwell共培养小室培养液上清中IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α表达;采用RT-qPCR法检测miR-23a-3p、PTEN、PI3K、AKT、mTOR的表达;采用WB法检测下室HCM中PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白的表达;采用免疫荧光法（Immunofluorescence,IF）检测下室细胞中脑利钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）、连接蛋白-43（Connexin-43,Cx43）、心肌肌钙蛋白I（Cardiac Troponin I,cTnI）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达。3结果3.1数据挖掘研究3.1.1 AS患者心功能参数及与免疫炎症指标相关性分析在238例患者中,心功能参数异常的例数共有97例,占40.75%。相关性分析显示,心功能指标与免疫球蛋白M（Immunoglobulin M,Ig M）、超敏-C反应蛋白（Hypersensitive c-reactive protein,hs-CRP）、血沉（Erythrocyte sedimentation rate,ESR）呈相关（P<0.05）。3.1.2 AS患者心功能参数与免疫炎症指标关联规则分析关联规则发现,主动脉内径（aorta diameter,AODd）升高与hs-CRP升高呈强关联,每搏输出量（stroke volume,SV）降低与hs-CRP、ESR升高呈强关联,以上关联规则支持度均>30%,置信度均>50%,提升度均>1。3.1.3 AS患者心功能参数与免疫炎症指标的二元Logistics回归分析免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,IgG）、hs-CRP是AODd的危险因素（OR>1）,ESR、Ig M升高是SV下降的危险因素（OR>1）。3.1.4 AS患者中药使用情况在1237张处方247味中药,使用频率前20名的药物为:（a）健脾化湿药:陈皮、茯苓、薏苡仁、山药、泽泻;（b）祛风湿药:威灵仙、豨签草、独活、川牛膝、伸筋草;（c）活血化瘀药:丹参、红花、桃仁、鸡血藤、川芎;（d）清热解毒药:蒲公英、白花蛇舌草、黄芩、黄柏、知母。3.1.5中药与心功能参数、免疫炎症指标的关联分析蒲公英合用丹参关联于hs-CRP下降,伸筋草合用山药关联于ESR下降。陈皮合用丹参关联于免疫球蛋白A（Immunoglobulin A,Ig A）下降,薏苡仁与杜仲合用关联于SV下降,薏苡仁合用独活关联于IgG下降,鸡血藤合用山药关联于补体C3（Complement3,C3）下降,川芎合用泽泻关联于Ig M下降,茯苓合用山药关联于补体C4（Complement4,C4）下降。薏苡仁与杜仲合用关联于SV下降。3.1.6 XFC联合中药与免疫炎症指标及心功能参数关联分析XFC联合单味中药薏苡仁与hs-CRP下降关联度高（置信度为80.31%）,XFC联合豨签草、黄芩、威灵仙与ESR下降关联度高（置信度为82.45%、83.25%、73.48%）,XFC联合薏苡仁、蒲公英、丹参与Ig M下降关联度高（置信度为73.32%、72.28%、72.38%）。XFC联合红花与AODd下降关联度高（置信度为65.29%）。3.2体内实验研究3.2.1一般情况在30例AS组中,男26例,女4例,年龄（42.50±9.91）岁;健康对照组（HCs）30例,男26例,女4例,年龄（43.50±5.60）岁。两组在年龄、性别等方面比较,差异无统计学意义。3.2.2两组免疫炎症指标、心功能参数的比较与HCs组相比,AS组患者hs-CRP、ESR水平明显升高（P<0.05）。两组Ig A、IgG、Ig M指标比较方面,差异无统计学意义（P>0.05）;射血分数（ejection fraction,EF）、SV、AODd明显有差异（P<0.05）,其余心功能参数无差异（P>0.05）。3.2.3两组miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路相关指标比较与HCs组相比,AS组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表达水平明显升高（P<0.05）,PTEN表达水平明显下降3.2.4两组细胞因子比较与HCs组相比,AS组IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显上调,而IL-10表达明显下调（P<0.05）。3.2.5 AS心功能参数与miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路、细胞因子相关指标的相关性分析AODd与miR-23a-3p、TNF-α呈正相关,SV与PI3K呈正相关（P<0.05）。3.3体外实验研究3.3.1 XFC含药血清对AS-CD4+T细胞联合AS-FLS共培养miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响（1）XFC含药血清对AS-CD4+T细胞联合AS-FLS共培养的细胞存活率影响细胞活力随着XFC含药血清浓度增加而降低,10%XFC含药血清在作用48h对AS-CD4+T细胞+AS-FLS活力最佳。故10%XFC含药血清为最佳作用浓度,48h为最佳作用时间。（2）ELISA检测各组细胞因子的表达水平相较于control-1、control-2组,model组中IL-1β、IL-6、TNF-α表达上调,IL-10表达下调（P<0.05）;而相较于model组,XFC组IL-1β、IL-6、TNF-α表达下调,抑炎因子IL-10表达相反。与model组相比,mimics组中IL-1β、TNF-α表达也明显上调,IL-10表达下调（P<0.05）。相较于mimics组,mimics+XFC组中IL-1β、TNF-α表达下调,IL-10表达上调（P<0.05）。（3）RT-qPCR检测各组miR-23a-3p/PI3K/AKT/mTOR的表达水平相较于control-1、control-2组,model组中miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表达上调,PTEN表达下调（P<0.05）;而相较于model组,XFC组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表达水平明显下调,而PTEN表达明显上调（P<0.05）。与model组相比,mimics-miR-23a组中miR-23a-3p表达明显上调,PI3K、AKT、mTOR表达也明显上调,PTEN表达下调（P<0.05）。相较于mimics组,mimics+XFC组中miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表达下调,PTEN表达上调（P<0.05）。（4）WB检测各组PTEN/PI3K/AKT/mTOR蛋白的表达水平相较于control-1、control-2组,model组中PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达上调,PTEN表达下调（P<0.05）;而相较于model组,XFC组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达水平明显下调,而PTEN表达明显下调（P<0.05）。与model组相比,mimics组中PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达也明显上调,PTEN表达下调（P<0.05）。相较于mimic组,mimics+XFC组中PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达下调,PTEN表达上调（P<0.05）。3.3.2 XFC含药血清对AS-CD4+T细胞联合HCM共培养miR-23a PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响（1）XFC含药血清对AS-CD4+T细胞联合HCM共培养的细胞存活率影响与同期阴性对照组相比,5%XFC组细胞存活率差异较小,各浓度XFC对AS-CD4+T细胞+HCM的细胞存活率作用随着作用时间的延长而减少,10%XFC含药血清在作用48h对AS-CD4+T细胞+HCM细胞存活率下降27.45%（P<0.01）。故10%XFC为最佳作用浓度,48h为最佳作用时间。（2）ELISA方法检测XFC含药血清对细胞因子的影响相较于control-1、control-2组,model组中IL-1β、IL-6、TNF-α表达上调,IL-10表达下调（P<0.05）;而相较于model组,XFC组IL-1β、IL-6、TNF-α表达下调,IL-10表达上调（P<0.05）。与model组相比,mimics组中IL-1β、TNF-α表达也明显上调,IL-10表达下调（P<0.05）。相较于mimics组,mimics+XFC组中IL-1β、TNF-α表达下调,IL-10表达上调（P<0.05）。（3）RT-qPCR方法检测XFC含药血清对miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR的影响相较于control-1、control-2组,model组中miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表达上调,PTEN表达下调（P<0.05）;而相较于model组,XFC组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表达水平明显下调,而PTEN表达明显上调（P<0.05）。与model组相比,mimics-miR-23a-3p组中miR-23a-3p表达明显上调,PI3K、AKT、mTOR表达也明显上调,PTEN表达下调（P<0.05）。相较于mimics组,mimics+XFC组中miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表达下调,PTEN表达上调（P<0.05）。（4）XFC含药血清对PTEN/PI3K/AKT/mTOR蛋白表达的影响相较于control-1、control-2组,model组中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达上调,PTEN表达下调（P<0.05）;而相较于model组,XFC组PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达水平明显下调,而PTEN表达明显下调（P<0.05）。与model组相比,mimics组中PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达也明显上调,PTEN表达下调（P<0.05）。相较于mimic组,mimics+XFC组中PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达下调,PTEN表达上调（P<0.05）。（5）免疫荧光法检测XFC含药血清对心肌细胞标志物表达的影响相较于control-1、control-2组,model组BNP、Cx43、cTnI、cTnT阳性表达显著增加,cTnI、cTnT异常聚集在HCM细胞浆内。BNP、Cx43分布于心肌细胞核内;与model组相比,XFC组cTnI、cTnT、BNP、Cx43阳性表达降低;mimics组心肌细胞cTnI、cTnT、BNP、Cx43荧光斑荧光增强的现象最强烈,在心肌细胞内的分布变得紊乱。与mimics组相比,mimics+XFC组cTnI、cTnT、BNP、Cx43荧光斑荧光明显减少。4结论4.1 AS伴心功能异常的患者占40.75%,且其与免疫炎症指标有明显的关联,中医药在治疗AS的同时能够改善患者的心功能。健脾化湿通络中药新风胶囊联合中药改善心功能的作用更加明显。4.2 AS心功能参数、miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路、细胞因子、免疫炎症指标与健康对照者之间存在明显差异。AS心功能异常与免疫炎症反应、miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路存在明显相关性。4.3健脾化湿通络中药XFC改善AS心功能的作用机制是下调miR-23a-3p的表达,上调PTEN的表达,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化;下调促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α,上调抑炎因子IL-10,抑制炎症反应;降低心肌细胞中cTnI、cTnT、BNP、Cx43的蛋白表达,从而改善AS患者心功能。