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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是人畜共患的细胞内寄生原虫。对于免疫功能正常的机体，弓形虫感染后呈隐性感染状态；而对于免疫功能低下的机体，则可能导致严重的临床后果。妊娠是一种特殊的免疫功能抑制状态，妊娠期感染弓形虫可以引起流产、早产、死胎、畸胎等不良妊娠结局。有报道称，用弓形虫培养上清注射到孕鼠体内也可以引起流产的发生。越来越多的研究表明，在妊娠过程中，随着孕程的增加，孕鼠体内CD4~+CD25~+T细胞占CD4~+T细胞的比例和正常小鼠相比，呈上升趋势，在流产的小鼠体内及蜕膜组织，CD4~+CD25~+T细胞的比例均明显下降。当小鼠体内缺乏CD25~+T细胞时，不能维持妊娠，而通过过继孕鼠体内的CD4~+CD25~+调节性T细胞能够明显降低流产的发生。这些研究表明，CD4~+CD25~+调节性T细胞在介导母体对胚胎这个半同种异体抗原的免疫耐受及维持妊娠方面发挥了重要作用。鉴于CD4~+CD25~+调节性T细胞在正常妊娠中的重要作用，弓形虫及其培养上清作用于孕鼠后，是否由于CD4~+CD25~+调节性T细胞数量和功能的变化，引起母体对胚胎的免疫耐受减弱，从而导致了流产的发生，目前尚未见报道。因此，在本研究中，我们分别采用体内和体外实验，观察了弓形虫培养上清处理后胚胎的发育情况和小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞数量和功能的变化，为阐明弓形虫培养上清引起孕鼠流产的免疫学机制提供实验资料。在体内实验中，注射弓形虫培养上清到孕鼠腹腔，观察胚胎的发育情况，并分析脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+ T细胞占脾脏单个核细胞的比例。在体外实验中，首先用免疫磁珠分离纯化正常小鼠脾脏组织的CD4~+CD25~+调节性T细胞，用弓形虫培养上清和完全RPMI-1640分别培养2h、5h、10h，采用同位素~3H-TdR掺入细胞增殖实验，分析不同处理的CD4~+CD25~+调节性T细胞对脾脏组织中CD4~+CD25~- T细胞增殖的抑制作用；然后运用流式细胞仪检测不同处理的单个核细胞中CD4~+CD25~+CTLA-4~+T及CD4~+CD25~+GITR~+T细胞占CD4~+CD25~+T细胞的比例；再用半定量PCR检测CTLA-4基因在不同处理的CD4~+T细胞中的表达情况；最后采用Annexin-v染色法检测不同处理的正常小鼠脾脏组织CD4~+CD25~+调节性T细胞的凋亡率。所有实验均设完全RPMI-1640孵育组为同期对照组。本实验主要获得如下结果：1、弓形虫培养上清能够引起孕鼠流产的发生。弓形虫培养上清注射到孕8天的孕鼠腹腔内，在孕14天时处死小鼠，解剖孕鼠子宫，发现胚胎全部出现坏死或者吸收，而对照组孕鼠胚胎全部发育良好。2、弓形虫培养上清能够引起孕鼠体内CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞及CD4~+CD25~+ T细胞占脾脏单个核细胞的比例下降。弓形虫培养上清注射到孕8天的孕鼠体内，在孕14天时处死小鼠，分离脾脏单个核细胞，FCM(流式细胞术)检测CD4~+CD25~+Foxp3~+ T细胞及CD~4+CD25~+ T细胞占脾脏单个核细胞的比例。和正常孕鼠相比较，弓形虫培养上清处理组这两种细胞占脾脏单个核细胞的比例下降。3、弓形虫培养上清孵育的CD4~+CD25~+调节性T细胞对CD4~+CD25~-T细胞增殖的抑制功能减弱。分选正常小鼠的CD4~+CD25~+调节性T细胞，分别用弓形虫培养上清和完全RPMI-1640进行孵育。结果显示：在ConA的刺激下，不同处理的CD4~+CD25~+调节性T细胞对CD4~+CD25~- T细胞增殖均有抑制功能，其中和对照组(完全RPMI-1640孵育)相比，弓形虫培养上清孵育5h、10h的CD4~+CD25~+调节性T细胞对CD4~+CD25~- T细胞增殖的抑制功能明显减弱。4、弓形虫培养上清能够使正常小鼠脾脏组织中CD4~+CD25~+CTLA-4~+ T及CD4~+CD25~+GITR~+ T细胞占CD4~+CD25~+ T细胞的比例均下降。分离正常小鼠的脾脏单个核细胞进行不同的处理，和对照组(完全RPMI-1640孵育)相比较，弓形虫培养上清处理的正常小鼠脾脏单个核细胞中CD4~+CD25~+CTLA-4~+T细胞及CD4~+CD25~+GITR~+T细胞占CD4~+CD25~+T细胞的比例均明显降低。5、弓形虫培养上清孵育的CD4~+T细胞中CTLA-4基因的表达下降。半定量PCR检测不同处理的CD4~+ T细胞中CTLA-4基因的表达情况，和对照组(完全RPMI-1640孵育)相比较，弓形虫培养上清孵育10h的CD4~+T细胞中CTLA-4基因的相对表达下降。6、弓形虫培养上清孵育的CD4~+CD25~+调节性T细胞易出现凋亡。FCM检测不同处理的CD4~+CD25~+调节性T细胞Annexin-v阳性率，相对于对照组(完全RPMI-1640孵育)而言，弓形虫培养上清孵育10h的CD4~+CD25~+调节性T细胞Annexin-v阳性率上升了(13.6±2.15)％，明显高于对照组(完全RPMI-1640孵育组)。弓形虫培养上清引起孕鼠流产涉及复杂的免疫学因素，而CD4~+CD25~+调节性T细胞的变化是发生流产的重要原因。本研究通过体内和体外实验，分别观察了弓形虫培养上清对CD4~+CD25~+调节性T细胞的影响，发现弓形虫培养上清能够下调CD4~+CD25~+调节性T细胞的数量，并减弱其抑制功能，表现在注射弓形虫培养上清的孕鼠，脾脏CD4~+CD25~+调节性T细胞占单个核细胞的比例下降；经弓形虫培养上清孵育处理，CD4~+CD25~+调节性T细胞易于出现凋亡，其抑制效应性T细胞增殖的能力减弱，并且，CTLA-4和GITR等功能相关分子的表达下降。本研究首次从免疫应答的角度，揭示了弓形虫培养上清对CD4~+CD25~+调节性T细胞的作用，以及CD4~+CD25~+调节性T细胞与流产的关系，为阐明弓形虫感染引起流产的机制提供了新的资料。