我国传统食醋多采用固态发酵工艺,具有微生物种类多样、生化反应和物化反应复杂的特征。山西老陈醋不仅具有独特的风味,并且含有四甲基吡嗪（TMP）、有机酸、氨基酸等多种健康和营养成分。TMP是山西老陈醋的风味物质,且是其重要的功能性指标。由于人们缺乏对微生物、化学物质和酿造环境三者之间关系的认知,山西老陈醋的酿造过程多以经验控制为主。因此,迫切需要建立以TMP形成机制为理论基础的代谢调控技术,以有效控制食醋产品功能性指标并保障产品质量。本课题以山西老陈醋为研究对象,系统揭示TMP在食醋生产全过程的变化规律;分析TMP前体物和微生物群落功能,揭示TMP在酿造全过程中的形成机制,并提出代谢调控策略。研究成果将为建立行业急需的TMP生产调控技术提供理论依据和技术支撑。引入“全过程动态分析”的研究思路,采用高效液相色谱（HPLC）、气相色谱质谱联用（GC-MS）、傅里叶红外光谱、差热分析（DSC）等方法,系统解析了TMP在食醋酿造全过程的动态变化,确定了熏醅阶段是TMP积累的主要阶段,且呈现出了TMP的合成与挥发损失之间动态变化的规律。采用“混样法”快速筛查策略,共筛查出20种TMP前体化合物,包括2种非含氮前体（乙偶姻和双乙酰）和18种含氮前体（包括铵、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸和半胱氨酸）,是山西老陈醋中TMP合成的主要前体。原料来源和发酵过程中的变化规律分析显示,TMP前体物主要在醋酸发酵过程中产生。采用宏基因组学测序技术,分析山西老陈醋中TMP前体化合物的合成途径及对应的功能微生物,重点分析乙偶姻和铵的合成。乙偶姻的合成途径有4条,分别为:丙酮酸脱羧酶催化丙酮酸（或丙酮酸+乙醛）生成乙偶姻;α-乙酰乳酸合成酶催化丙酮酸合成α-乙酰乳酸,再由α-乙酰乳酸脱羧酶催化α-乙酰乳酸生成乙偶姻;α-乙酰乳酸非酶促反应生成的双乙酰在双乙酰还原酶作用下生成乙偶姻;2,3丁二醇在乙偶姻还原酶作用下生成乙偶姻。其中,α-乙酰乳酸（或经双乙酰）合成乙偶姻是乙偶姻的主要合成途径,主要的功能微生物是巴氏醋杆菌、耐酸乳杆菌和酿酒酵母。铵的合成途径有7条,分别为:甲酰胺酶催化甲酰胺转化为铵;硝酸盐还原酶催化硝酸盐转化为亚硝酸盐,亚硝酸在铁氧还蛋白-亚硝酸盐还原酶和亚硝酸还原酶催化下合成铵;氨基甲酰磷酸在氨基甲酸酯激酶催化下转化为氨基甲酸,氨基甲酸分解产生铵;谷氨酰胺在谷氨酸合成酶催化下转化为谷氨酸和铵;谷氨酸在谷氨酸脱氢酶催化下生成铵;腈水解酶催化腈类生成铵;脲基甲酸酯水解酶催化脲基甲酸生成铵。其中,由氨基甲酸、亚硝酸盐、谷氨酸以及尿素四者转化为铵的途径是铵合成代谢中的主要代谢途径,主要的功能微生物是巴氏醋杆菌、酿酒酵母和远缘链球菌。采用宏转录组学测序技术,通路分析筛选出了TMP非含氮前体代谢的酶系和具有调控作用的关键酶,确定了乳酸与丙酮酸之间的转化是调控TMP非含氮前体的合成的关键步骤。关键代谢途径的分析显示,TMP非含氮前体可能主要由乳酸菌（以耐酸乳杆菌为主）和醋酸菌（以巴氏醋杆菌为主）的协同代谢产生。冗余分析（RDA）和功能微生物纯培养方法分析和验证了乳酸菌和醋酸菌的协同代谢,发现乙醇、乙酸和乳酸是TMP非含氮前体代谢的主要影响因素,在乙醇和乙酸条件下,关键代谢途径中乳酸菌的主要作用仍然是产乳酸;乳酸能够显著提高巴氏醋杆菌乙偶姻的产量,而在不含乳酸条件下巴氏醋杆菌的乙偶姻产量极低。因此,山西老陈醋醋酸发酵过程中TMP非含氮前体主要来源于巴氏醋杆菌将耐酸乳杆菌产生的乳酸转化为乙偶姻。此外,巴氏醋杆菌的代谢特征显示,乙醇、乳酸和乙偶姻作为巴氏醋杆菌的碳源和能源,它们被利用的先后顺序为乙醇＞乳酸＞乙偶姻,高浓度乙醇有利于乳酸向乙偶姻转化。代谢网络的构建揭示了TMP非含氮前体在醋酸发酵过程中的全局调控机制。随着乙醇的消耗和酸度的提高,乙酸的细胞毒性使得微生物的一些代谢减弱,如大部分的碳水化合物代谢;食醋微生物通过能量代谢、PPP、核酸代谢和氨基酸代谢的加强维持细胞内环境的稳定和细胞结构物质的合成与修复,以抵抗酸的细胞毒性。作为碳源和能源,乙醇和乳酸为抵抗酸的细胞毒性而被食醋微生物利用,它们的含量及被利用的先后顺序是影响TMP非含氮前体积累的关键。在生理意义上,乳酸向TMP非含氮前体的转化是食醋微生物避免细胞过度酸化和富含碳源/能源时的暂时储能策略。双乙酰含量的降低与醋酸发酵氧气充足和α-乙酰乳酸合成酶酶活提高有关。宏转录组通路分析筛选出的41种酶组成TMP含氮前体代谢的酶系,并进一步通过调控网络分析,从酶系中筛选出具有调控作用的关键酶,确定了发酵体系中谷氨酰胺与铵之间的转化路径是TMP含氮前体代谢的关键步骤,起关键作用的微生物为昆克乳杆菌、耐酸乳杆菌和巴氏醋杆菌。RDA对TMP含氮前体与潜在影响因子之间的关联性分析显示,乙酸与铵的相关性最大,可能是主要的影响因子。采用功能微生物（瑞士乳杆菌、耐酸乳杆菌和巴氏醋杆菌）纯培养的方法验证乙酸对乳酸菌和醋酸菌中铵代谢的影响。乙酸胁迫条件下,微生物通过关键酶（谷氨酰胺合成酶）基因上调,使胞内铵浓度上升,以提高菌体的乙酸耐受性。根据酶系构建了TMP含氮前体的代谢网络,并揭示其代谢机制:乙酸的细胞毒性对细胞结构和内环境造成损伤,微生物通过增强氨基酸代谢、核酸代谢、PPP和能量代谢以应对酸的细胞毒性,通过增强氮源同化为这些代谢途径提供了氮,从而维持了内环境的稳定和胞内高浓度的铵,胞内铵扩散到胞外导致铵积累,而氨基酸代谢的加强促进了TMP氨基酸类前体的合成。基于TMP前体的代谢机制,采用生物强化的方法对山西老陈醋TMP进行代谢调控。选取TMP非含氮和含氮前体代谢共有的功能微生物原位菌株（瑞士乳杆菌和巴氏醋杆菌）作为强化菌株,单培养和共培养显示两株菌的相互作用关系为“偏害共生”。在此基础上,提出了TMP代谢调控的“分段式”菌剂添加策略:发酵起始（AAF1d）添加乳酸菌以保证乳酸菌生长并提高乳酸的含量,发酵中前期（AAF3d）添加醋酸菌以提高醋酸菌丰度将乳酸转化为乙偶姻。经原位验证,生物强化使TMP非含氮前体和含氮前体的含量分别提高了11.90%和6.42%,最终使TMP含量提高了7.23%。因此,该代谢调控策略能够有效提高山西老陈醋中TMP的含量。除此之外,感官评价显示食醋的主体风味不变,乳酸/乙酸的提高（提高幅度为15.09%）使食醋口感更加柔和。综上,该调控策略有效使功能性指标TMP含量显著提高,并改善了食醋风味,在总体上提高了食醋的品质。