氰戊菊酯免疫分析化学研究

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本实验以氰戊菊酯为研究对象,从不同的化学途径,合成了两种结构不同的氰戊菊酯半抗原Fen-Hp1、Fen-Hp2。采用活性酯法将半抗原与载体蛋白BSA和OVA共价偶联,制备了多种人工抗原,经紫外扫描确定偶联成功后,以Fen-Hp1-BSA、Fen-Hp2-BSA为免疫原免疫新西兰白兔,分别获得了针对两种半抗原的特异性抗血清。间接ELISA法测定抗血清的中点效价分别为3.2×104和2.4×104,双向琼脂扩散法测定抗血清的效价为1/32。以硫酸铵分步盐析法分离纯化抗血清中的抗体并冻干得抗体1(Ab1)和抗体2(Ab2)。用活性酯法制备酶标半抗原1(Fen-Hp1-HRP),酶标记物既保持了免疫化学特性,又保持了酶活性,可用于免疫化学分析。 进一步研究了pH值、离子强度、吐温20和有机溶剂在包被抗体—酶标半抗原(E-H)直接竞争ELISA中对氰戊菊酯与抗体1亲合作用的影响。结果表明:包被介质pH为6.4时,固相载体对抗体1的吸附性最好;反应介质pH为6.8时,抗体1与氰戊菊酯的亲合作用最强,在pH偏碱条件下,亲合作用减弱;离子强度在一定范围内增大会提高抗体1与氰戊菊酯的亲合力;吐温20降低氰戊菊酯免疫分析的灵敏度;丙酮和乙腈含量大于5%影响氰戊菊酯的免疫分析结果。 成功建立了氰戊菊酯直接竞争酶联免疫吸附分析法。方阵试验确定了纯化抗体1最佳包被浓度为8μg/mL,酶标半抗原(Fen-Hp1-HRP)最佳稀释度为12000倍。在优化条件下,建立了氰戊菊酯的标准抑制曲线,回归方程Ⅰ=67.22+21.62LogC,r=0.9939,线性范围为10~0.001μg/mL,抑制中浓度(IC50)为0.1598μg/mL,IC20为6.545ng/mL,相对标准偏差(RSD)=12.86%(n=6)。 在空白青菜样品中分别添加氰戊菊酯标样,使样品中氰戊菊酯的含量分别为0.5mg/kg和5mg/kg两个水平。添加样品用乙腈提取,SEP-PAK C18柱净化,E-H直接竞争ELISA法测定,重复5次。氰戊菊酯添加浓度为0.5mg/kg水平时,回收率83.76%~109.5%,RSD为11.71%;氰戊菊酯添加浓度为5mg/kg水平时,回收率93.64%~109.7%,RSD为7.25%。说明E-H直接竞争ELISA法能满足氰戊菊酯残留分析的要求。 成功建立了用于含间苯氧基苄醇(PBM)结构的拟除虫菊酯检测的间接竞争ELISA(IC-ELISA)法。在优化条件下建立了PBM的标准抑制曲线,回归方程Ⅰ=49.21+14.71LogC,r=0.9973,线性范围为10~0.001μg/mL,IC50为1.132μg/mL,
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