目的心力衰竭(Heart failure,HF)是各种心血管疾病的终末阶段及严重临床表现。2018年中国心力衰竭诊断和治疗指南中对于HF的定义为:“心衰是多种原因导致心脏结构和/或功能的异常改变,使心室收缩和/或舒张功能发生障碍,从而引起的一组复杂临床综合征,主要表现为呼吸困难、疲乏和液体潴留(肺淤血、体循环淤血及外周水肿)等。”随着社会经济的发展和人均寿命的延长,人口老龄化现象日益严重,疾病谱也发生了变化,使得HF的发病率和死亡率逐年升高。因此,阐明HF发生和演进的病理生理机制并寻找新的治疗靶点已成为HF研究中亟待解决的医学问题。脂联素(Adiponectin,APN)是脂肪组织分泌的最丰富的脂肪因子之一,于1995年被Scherer等人发现并首次报道。APN是一种分子量为30千道尔顿的单分子糖蛋白,由氨基端信号序列,胶原样结构域和羧基末端的C1q球状结构域3部分构成。APN通过多种信号通路发挥改善胰岛素抵抗、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗凋亡、促血管生成和促脂肪生成的等有益生物学效应。既往的细胞与动物学研究证实,APN是重要的心血管和代谢保护因子。但是,近年来大量临床研究发现,HF患者血清APN水平增加,与疾病严重程度呈正相关,进而提出了“脂联素悖论”观点。那么,做为一个心脏保护因子,APN在HF预后不良患者中显著增加的病理机制和生物学功能是什么?是对抗还是加重心功能损伤?APN血清学水平的增加与HF严重程度的相关关系,能否使其成为一个预测HF预后不良的生物标志物?这些问题迄今尚未阐明。为明确APN表达与HF的关系,本实验尝试通过临床队列研究探讨慢性HF患者血清中APN的表达变化与演进的关系及其调控机制;同时,应用高脂喂养建立糖尿病小鼠HF模型,检测小鼠血清APN水平的变化与HF发生的时相关系,并通过给予HF小鼠外源性重组APN干预,观察重组APN对HF的治疗作用,初步探讨其调控机制。方法(1)连续入选2017年1月至2018年8月因慢性心力衰竭就诊于北部战区总医院且符合本研究入选标准的研究对象194例。患者于入院后由其经治医师进行病史询问及详细的体格检查;由专业医师完成心电图、心脏超声检查;次日清晨在空腹静息状态下进行外周静脉采血,行血常规、N端脑钠肽前体(N-terminal pro b-type natriuretic peptide,NT-pro BNP)、可溶性生长刺激表达因子2(soluble suppression of tumorigenicity 2,s ST2)、心肌酶、凝血系列、肝肾功、甲功、血脂、空腹血糖等血液学指标检测。运用SPSS22.0统计软件进行统计分析,以此来分析血浆APN浓度与相关临床指标及其他HF血液生化标志物的相关关系。(2)入选因需行体外起搏器植入术的HF患者9例、房室传导阻滞患者5例。在其行体外起搏器植入术制备皮下囊袋的过程中留取其左前胸部大小为1cm×1cm×1cm大小的皮下脂肪组织一块。应用Western blot技术检测APN的蛋白表达。以此检测HF患者与对照者皮下脂肪组织的APN表达情况。(3)应用8周龄的C57BL6J雄性小鼠给予高脂高糖饮食(high fat diet,HFD)喂养28周建立HF模型。造模过程中定期检测体重及心脏超声,评价造模情况。待造模完成后,在全身麻醉后处死,留取全血、脂肪和心脏标本。应用ELISA和Western blot技术检测小鼠不同时间点血浆和脂肪组织APN表达变化,评价APN表达与心功能的关系。应用western blot方法检测HF小鼠脂肪组织中AMPKα2及p AMPK蛋白的表达,评价HFD喂养前后小鼠脂肪组织中AMPKα2表达及活性变化与APN表达相关关系。进一步腹腔连续注射AMPK抑制剂Compound C 7天,检测AMPK表达对APN的调控作用。阐明AMPK活性下降是否诱导HF小鼠脂肪组织中APN的表达及分泌。(4)采用3T3L1脂肪前体细胞系,分别应用AMPK抑制剂Compound C及Si-AMPKα2低表达AMPK及AMPKα2。应用Western blot技术检测APN、AMPKα2及p AMPK蛋白的表达。以明确AMPK活性抑制是否调控APN的表达。(5)选取6只HF成模的HF小鼠,以325μg/kg*d剂量,持续28天皮下泵入重组APN蛋白。在给药过程中定期行心脏超声检测其心功能。给药结束后处死小鼠,留取血液,摘取脂肪和心脏组织。应用HE染色评价心脏大体形态,应用免疫组化技术评价心肌炎症浸润程度,应用ELISA试剂盒测定其血浆APN浓度;尝试阐明外源性给予皮下持续泵入重组APN对于HF小鼠的治疗作用。进一步应用Western blot技术检测APN治疗前后小鼠血浆及脂肪组织中APN、AMPKα2与p AMPK蛋白的表达。并对HF患者的皮下脂肪行体外组织培养,给予其0.2mg/ml浓度的重组APN。Western blot检测APN、AMPKα2和p AMPK蛋白的表达。以期验证体外给予重组APN蛋白后HF小鼠与HF患者皮下脂肪中APN、AMPKα2与p AMPK的表达变化。结果(1)HF患者血浆APN水平与LVEF呈负相关(r=-0.20,P=0.01),与LVEDD呈正相关(r=0.16,P=0.03),与NYHA分级呈正相关(r=0.12,P=0.05);以上3项临床HF严重程度诊断指标与APN之间的相关性均有统计学意义。血浆APN浓度与体重(r=-0.10,P=0.16)及身体质量指数(r=-0.10,P=0.17)存在负相关趋势,但无明确统计学意义。APN与NT-pro BNP浓度呈正相关(r=0.29,P<0.01),二者之间相关性具有显著统计学差异。APN与s ST2浓度虽无统计学差异,但二者浓度之间存在正相关趋势(r=0.13,P=0.06)。(2)HF患者皮下脂肪组织中APN表达较对照组表达明显增高。进一步,我们以HF患者LVEF值进行分组,检测患者皮下脂肪中APN蛋白表达情况与LVEF的相关关系。结果证实,LVEF≤35%组HF患者的皮下脂肪组织中APN的表达量明显高于50%≤LVEF≥35%HF患者。(3)HFD喂养20周后,小鼠体重曲线呈明显下降趋势。心脏超声检测提示,LVEF由HFD喂养前的53.03±2.80%下降为HFD喂养28周末的38.08±1.92%(P<0.01);FS由26.98±1.81%下降至18.44±1.07%(P<0.01);舒张末期左室前壁厚度(LVAW)由0.73±0.03mm增至0.84±0.07mm(P=0.25);校正后左心室重量(LV Mass AW)由85.71±4.30mg增至129.32±7.33mg,提示HF小鼠造模成功。小鼠的血浆APN浓度在造模过程中呈现先降低、后增高的趋势:在造模14周时造模小鼠的血浆APN浓度为2928±129ng/ml,明显低于对照组小鼠(4134±455ng/ml,P<0.05),给予HFD喂养28周造模成功的心衰小鼠其血浆APN浓度为12680±753ng/ml,明显高于对照组(P<0.05)。为阐明APN在HF中表达增加的分子机制,我们应用western-blot检测HFD喂养前后小鼠脂肪组织中APN表达变化情况。HFD喂养14周时,脂肪组织中APN表达降低;而HFD喂养28周时,脂肪组织中APN表达显著增高。用Western blot验证HFD喂养不同时间点,小鼠脂肪组织中AMPKα2表达及活性变化。结果发现,与对照组小鼠相比,HFD喂养28周后,小鼠脂肪组织中AMPKα2与p AMPK的表达均明显下降。与生理盐水对照组比较,Compound C注射7天后,APN在脂肪组织表达均显著增加。应用ELISA法测定两组小鼠血浆APN浓度,Compound C注射组小鼠其血浆APN值(9963±736pg/ml)明显高于对照组(4377±319pg/ml),有统计学意义(P<0.05)。同时,m RNA水平检测发现,Compound C干预不增加小鼠脂肪组织中APN m RNA表达。(4)用AMPK抑制剂Compound C及Si-AMPKα2干预AMPK及AMPKα2表达后,可显著增加APN蛋白表达,但不影响转录水平表达。(5)给予外源性重组APN治疗的HF小鼠不同时间点的心脏超声结果显示,APN重组蛋白治疗组小鼠LVEF由初始的34.54±0.97%增加至48.20±3.19(P<0.01),FS值由16.46±0.51%增加至24.38±1.95(P<0.01)。LVAW和LV mass AW值虽未达到逆转,但与对照组HF小鼠比较,从给药14天后呈现明显的进展减缓。进一步的病理学结果证实,与正常C57小鼠心脏大体标本比较,HF小鼠心脏的心腔显著增大,心肌肥厚,整体呈肥大态;给予重组APN治疗后,小鼠心脏与未治疗组小鼠比较未见明显缩小。CD68免疫组化染色提示,HF小鼠心肌组织中CD68阳性的巨噬细胞浸润明显,给予重组APN治疗后CD68阳性的巨噬细胞浸润明显减少,提示其炎症程度得到明显改善。以上结果证实,HF小鼠持续外源性皮下泵入重组APN,可有效减少炎症浸润,改善心功能。(6)应用Western blot技术检测重组APN蛋白干预前后HF小鼠皮下脂肪中AMPK表达和活性。与未治疗组相比,APN治疗28天后心衰小鼠脂肪组织中AMPKα2及p AMPK表达量增加。进一步,我们对HF患者脂肪组织进行体外培养并给予外源性重组APN干预研究,也证实APN重组蛋白干预能够改善HF脂肪组织中AMPK活性,降低APN表达。结论血浆APN水平与HF患者疾病严重程度存在正相关关系,与HF生物标志分子NT-pro BNP存在正相关关系,提示其有可能成为一个HF预后的生物标志分子。动物学研究证实,HF小鼠血清APN水平较正常小鼠显著增加。同时,给予HF小鼠皮下持续泵入重组APN蛋白可以改善心功能及炎性浸润,抑制HF演进。进一步动物和细胞学研究证实,APN与AMPK存在双向调节关系,抑制AMPK特别是AMPKα2后可上调APN蛋白表达。