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肥胖基因(obese gene,ob基因)是近年来克隆的一个基因,该基因产物—Leptin是反映体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子,对采食和能量消耗的调节起着关键作用。Leptin能显著降低脂肪组织数量、促进青春期发育、调节生殖机能、造血功能等。着眼于ob基因的开发和利用,本文利用RT-PCR技术克隆了北京鸭的ob cDNA,并与其他物种进行了同源性比较。 本实验用一步提取法从北京鸭脂肪、肝脏等组织中提取总RNA,参照小鼠和人的共同序列,根据已经报道的鸡肥胖基因所编码的Leptin蛋白的cDNA序列设计特异性引物,用RT-PCR技术扩增出北京鸭ob基因,长约463bp并进行回收。将回收的ob基因片段与PUC18—T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,利用蓝白斑遗传学筛选方法筛选阳性克隆。对含目的片段的阳性克隆进行细菌培养,从菌液中提取质粒DNA,进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果表明PCR目的片段已经克隆到PUC18—T载体上,而且插入片段与目的片段大小一致,表明成功地进行了北京鸭肥胖基因蛋白编码序列的克隆和筛选。 测序结果表明,北京鸭ob基因长463bp,编码135个氨基酸,1个开放阅读框。对北京鸭和其它物种进行同源性比较,与人、鼠、猪、鸡、牛、羊的ob基因序列同源性分别为81%、91%、81%、95%、83%和83%,在氨基酸水平的同源性分别为67%、77%、62%、80%、65%、64%。