论文部分内容阅读
目的：在于应用RNAi技术建立hTR基因缺陷的16HBE细胞株，尝试用人工诱变方法诱导该细胞发生恶性转化，建立hTR基因缺陷的人类细胞体外肿瘤发生模型，为研究人类肿瘤发生中hTR基因的功能及相关作用分子的筛选提供平台。
方法：⑴在pUC119-U6载体U6启动子下游插入干扰序列获得pUC119-U6-shRNA1、2表达体。⑵将两个pUC119-U6-shRNA1、2表达体中U6-shRNA1、2分别克隆入pEGFP—C1中，获得带有抗生素标记和便于观察的绿色荧光蛋白基因的重组质粒pEGFP—U6-shRNA1、2。⑶将重组质粒pEGFP—U6-shRNA1，2及空载体pEGFP—C1分别经脂质体瞬时转染16HBE细胞72小时后，提取各组细胞的总RNA，用RT—PCR检测hTR基因的沉默水平。⑷将有效干扰作用的重组表达体pEGFP—U6-shRNA1及空载体pEGFP—C1分别经脂质体转染16HBE细胞，经药物G418加压筛选及绿色荧光挑选后，获得两株稳定转染的细胞株，称16HBE-1，16HBE—C1。⑸提取各组细胞总RNA，用RT—PCR检测稳定细胞株中hTR基因的沉默水平。⑹MTT法绘制生长曲线以及流式细胞术检测细胞周期变化。⑺通过绝对克隆形成率和相对克隆形成率确定MNNG的转化实验浓度。⑻MNNG分别隔代染毒16HBE、16HBE—C1和16HBE-1至27代。⑼细胞生长状态的观察、生长曲线测定、软琼脂克隆形成实验初步鉴定细胞的恶性转化。
结果：①测序证实pUC119-U6-shRNA1、2表达体碱基序列无误；②测序证实改造后重组质粒pEGFP—U6-shRNA1、2碱基序列无误；③转染各质粒的16HBE细胞中，转染pEGFP—U6-shRNA1组hTR的mRNA表达明显降低；而pEGFP—U6-shRNA2组hTR的mRNA表达降低无明显变化，该组将不再进行稳定克隆株的筛选；④成功获得16HBE-1和16HBE—C1稳定转染细胞株；⑤16HBE-1细胞株中hTR的mRNA表达较16HBE和16HBE—C1细胞明显降低，16HBE—C1细胞株中hTR的mRNA表达无明显变化；⑥16HBE-1细胞生长速度较16HBE和16HBE—C1细胞生长显著减慢；16HBE-1与16HBE和16HBE—C1相比，其细胞周期均有明显改变；⑦确定1ug/ml作为有效转化实验的剂量；⑧连续染毒至第27次的16HBE-1细胞中首先出现“转化灶”；⑨分离转化灶细胞并扩大培养后的细胞获得以下特性：细胞呈密集单层并堆积、生长速度加快、能在软琼脂中生长等。
结论：⑴成功构建pUC119-U6-shRNA1、2表达质粒和pEGFP—U6-shRNA1、2表达重组体；⑵筛选出一个有效干扰质粒pEGFP—U6-shRNA1；⑶获得稳定转染pEGFP—U6-shRNA1的16HBE-1细胞株；⑷16HBE-1细胞株生长速度明显减慢，细胞周期发生变化；⑸MNNG染毒至第27代的16HBE-1细胞出现明显的“转化灶”；⑹细胞呈密集单层并堆积、生长速度加快、能在软琼脂中生长初步说明已建立了恶性转化细胞。