螺蛳中生物活性物质的研究

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螺蛳是我国城乡居民普遍喜欢食用的贝壳类水产,年产量达数千万吨,属于软体动物门腹足纲前鳃亚纲田螺科。螺蛳具有丰富的营养,但目前对螺蛳的利用仅限于作为一种水产小吃和水产养殖业的饲料,这是一种来源广泛而廉价的有待开发和利用的优质动物性资源。 本论文全面分析了螺蛳软体部分中各种生物活性物质,这些工作包括提取多糖或糖原组分并对组成和结构进行分析;通过小鼠实验对螺蛳糖原的抗疲劳生理活性进行研究;提取螺蛳蛋白并分析其性质;对螺蛳腹足肌进行酶解,并对其中的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽进行分离提纯和结构鉴定。 论文首先以不同的工艺从螺蛳的软体部分中提取出多糖或糖原组分并对其组成和结构进行了全面分析。用酶法提取螺蛳粗多糖,其单糖组成中葡萄糖占88.53%(w/w),半乳糖占7.40%(w/w),此外还含有36.45%(w/w)的蛋白。用碱法提取中性糖即糖原,其相对分子质量约为77000,单糖组成分析显示只含有葡萄糖,用酶法测定其分支化结构参数,平均链长,外链和内链平均长分别为12,7和4;β-淀粉酶水解率为40%;A,B链比为0.7:1.0,分支化度为1.7。对酸性糖即糖胺聚糖进行了分离与鉴定,样品中含有24.61%的氨基葡萄糖,经琼脂糖凝胶电泳推测其中肝素或刺参糖胺聚糖较多。 论文对螺蛳糖原的抗疲劳生理活性进行了研究,让以不同剂量螺蛳糖原(10、25、50mg·kg<-1>·d<-1>)灌胃的小鼠游泳进行疲劳实验并检测运动耐力指标和生化指标。结果表明,螺蛳糖原对于小鼠糖原的储备有利,对小鼠肝糖原储备的促进比肌糖原更大。螺蛳糖原有助于提高游泳前后小鼠乳酸脱氢酶(LDH)活力,降低血乳酸及血尿素氮在运动后含量的增幅,加速二者的清除。这说明,螺蛳糖原能以能量储备的形式使小鼠耐力增加,对负荷的适应性增强,延缓疲劳的产生,达到抗疲劳的目的。 螺蛳腹足肌中蛋白质组分也是研究重点之一。螺蛳腹足肌肉粉溶液的粘度在pH11处达到最大值。碱提螺蛳蛋白的等电点为约pH4.7±0.1。通过碱提酸沉法提出的螺蛳蛋白,经圆二色谱测定其二级结构随pH值的升高会变得较为松散,至pH12时变为以β-折叠为主要构象。螺蛳腹足肌原料和碱提酸沉蛋白的氨基酸组成基本相似,前者的必需氨基酸指数(EAAI)为92.6。在关于起泡性和乳化性的实验中发现,螺蛳蛋白在浓度2.0%(w/v)时起泡能力达到最大值,浓度高于0.5%(w/v)时乳化性及乳化稳定性的增幅都趋于平缓。经差式扫描量热法(DSC)测定,在碱性环境中螺蛳蛋白的变性温度会随着pH值的升高而降低。pH10提取的螺蛳蛋白的变性温度为119.67℃。同时还发现通过粉碎、超声波处理、高速分散及碱溶等多种方法可以增加螺蛳腹足肌中蛋白组分的溶解度。经过超声和高速分散处理,在pH10条件下溶液中螺蛳蛋白得率达55.62%。这部分工作为螺蛳蛋白的酶解打下了基础。 为把螺蛳蛋白中可能蕴含着的大量具有活性的肽片段释放出来,提高它作为一种动物蛋白资源的功能性和价值,对螺蛳的腹足肌进行了酶解。从酶解产物的蛋白得率、相对分子质量分布和ACE抑制活性三方面比较,从6种蛋白酶中选择Proleather FG-F碱性内切蛋白酶作为水解螺蛳腹足肌的最适酶种。经响应面优化及相关分析得出Proleather FG-F最佳酶解条件为:加酶量5%,温度58.5℃,pH9.6~9.8,底物浓度5%(w/v),酶解时间4h。Proleather FG-F酶解产物与腹足肌原料相比,灰分明显减少,由16.48%(w/w)下降至9.82%(w/w);重金属含量大大降低。ACE半抑制浓度IC<,50>为0.69mg/mL。Proleather FG-F酶解产物在经过体外模拟胃肠道消化酶的处理后相对分子质量在150~1500范围内短肽比例由84.85%下降为77.4%,ACE抑制活性由46.23%增加至49.46%。 通过DA201-C大孔吸附树脂、201×7型强碱性阴离子树脂、Sephadex G-15凝胶色谱和半制备反相高效液相(RP-HPLC)对螺蛳腹足肌酶解产物ACE抑制肽进行脱盐及分离提纯,ACE半抑制浓度IC<,50>值逐步降低,最后所得的组分A6-G2-R8-2基本上为单一肽组分。分别使用液相色谱/电喷雾离子质谱法(LC/ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-TOF MS)对A6-G2-R8-2的一级结构进行测定,同时结合氨基酸组成分析结果最终确定所得的螺蛳ACE抑制肽为一种四肽KEIW(Lys-Glu-Ile-Trp),该肽一级结构符合已知的高活性ACE抑制肽的结构规律,其ACE半抑制浓度IC<,50>值为43.5μM。
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