翅面被覆鳞片是鳞翅目昆虫的主要特征之一;鳞片对于鳞翅目昆虫具有重要的生理意义,而鳞片构成的各种翅面图案具有特定的发育机制和进化模式,因此鳞翅目昆虫的鳞片在昆虫生理学、发育生物学以及生物进化,甚至害虫防治上都具有重要的研究价值.本文以家蚕无鳞片翅突变体scaleless (sl)为材料,从形态学、细胞生物学和分子生物学角度对突变体的产生机理进行了研究,力图阐明无鳞片翅突变表型的发生机理;并为鳞翅目昆虫鳞片的发育机制提供理论参考. 首先从探明家蚕翅的生长发育机制入手,调查了五龄幼虫及蛹期翅原基(翅)的大小和形态变化,并建立了翅原基摘除和移植技术,为论文的深入研究提供实验和理论基础.翅原基在五龄前期生长缓慢,变态前生长最快;蛹期翅芽大小基本不变,但伴随有鳞片的形成和色素沉积过程.家蚕幼虫期的造血器官紧密附着在翅原基上,形成造血器官一翅原基复合体.五龄早期将4个造血器官一翅原基复合体全部摘除,家蚕幼虫仍能正常生长并发育成蛹和具有交配及产卵能力的蛾;同时其发育过程中血球总数仍呈增长趋势,但是明显低于正常蚕,由此推测化蛹变态中造血器官的崩解是变态的结果而不是其必要因素.全部造血器官一翅原基复合体摘除后配合使用MH或JHA均会增加熟蚕体内的血球数量,认为保幼激素在造血器官一翅原基复合体全部摘除的蚕体内有促进血球有丝分裂的作用. 运用建立的翅原基(翅)解剖技术,分析了家蚕突变体scaleless的表型性状,发现其成虫翅面鳞片明显比野生型(WT)的少,并且所具有的少量鳞片比野生型的小且分叉少.五龄幼虫翅原基的相互移植实验证明决定这一突变性状的调控因子不存在于体液中,而是存在于翅原基自身内部.化蛹前scaleless的翅原基与WT的在形态和结构上没有明显差异,化蛹后WT家蚕的翅脉开始出现气管分叉并延伸进入翅面,2 d蛹时已经可以看到翅脉之间的气管相互交织形成网状;但是scaleless家蚕蛹的翅脉中气管分叉少并且延伸不良.蛹期经过高氧分压处理可以部分挽回scaleless家蚕翅面的鳞片,使其成虫翅面鳞片明显增多.在幼虫五龄早期的翅原基表面划一道浅的刻痕使翅脉受伤,亦可形成成虫翅面鳞片少的表型.因此我们推测翅原基的翅脉中气管发育异常致使翅面细胞缺氧是导致scaleless鳞片变少的一个重要原因. 进一步实验阐明了 scaleless 突变体家蚕细胞生物学方面的产生机理.AO/EB染色及Caspase-3/7活性分析结果显示在蛹的早期,翅面鳞片的发育伴随有细胞凋亡的参与.2 d时大量翅面细胞凋亡,存活的细胞则整齐地排列在翅的表面.scaleless家蚕不同于野生型,其翅面大量细胞凋亡现象比WT出现的晚1天,且翅面细胞几乎全部死亡;并且Caspase-3/7的最大活性相当于WT的近10倍.同时有关凋亡小体和DNA片段化的实验结果也说明scaleless蛹期翅面细胞过度凋亡,从而产生了成虫翅面少鳞片的突变性状. AS-C基因与果蝇背板刚毛的发育有关;AS-C的同源体基因(ASH)B-ASH,也控制着蝴蝶翅面鳞片的形成.为了从分子生物学角度阐明家蚕scaleless突变体的产生机理,克隆并鉴定了家蚕的AS-C同源体基因.发现家蚕至少有四个ASH基因,分别命名为Bm-ASH1、Bm-ASH2、Bm-ASH3和Bm-ase四个基因均具有明显的bHLH基序,并且前三个基因编码的蛋白质的C-端也具有16～17个氨基酸组成的保守区,这些都符合AS-C同源体基因的特点.同源性比较和进化分析说明三个原神经基因中Bm-ASHl是最早分化形成的一个;Bm-ASH2和Bm-ASH3同源性最高,推测相对于Bm-ASH1形成较晚.用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测了家蚕ASH基因在幼虫期不同组织器官及胚胎发育过程中的表达情况,发现Bm-ASH1和Bm-ASH2表达范围最广,胚胎发育过程中也有较高的表达量;而Bm-ASH3表达特异性相对较高,因此推断其形成较Bm-ASH2为晚,即Bm.ASH.;是四个家蚕ASH基因中最晚形成的一个.ase基因主要在神经前体细胞中表达,因此Bm-ase表达范围较窄,组织中总体表达量较低.但同源比较和功能分析都不能将家蚕的三个原神经基因和果蝇的一一对应,因此其命名依然按照发现的先后顺序进行. 通过半定量RT-PCR发现家蚕的吐丝期和蛹期,Bm-ASH1和Bm-ASH3基因在scaleless和WT家蚕中的表达时相几乎一致;Bm-ASH2只在0 d～2 d的WT蛹翅中表达,而scaleless中没有检测到表达信号.原位杂交结果也证明Bm-ASH2在scaleless蛹翅中不能正常表达.将WT及 scaleless的Bm-ASH2基因起始密码子上游的启动子序列克隆并测序,发现scaleless的ATG上游1027 bp处有一段连续26 bp的缺失突变.利用家蚕细胞瞬时表达系统分析了Bm-ASH2基因启动子活性,发现scaleless比WT低得多,只与截去了其缺失的26 bp的979 bp WT启动子片段的活性相当.EMSA结果显示scaleless缺失的26 bp序列可以特异性结合某种核蛋白.遗传学实验则证明26 bp序列缺失与无鳞片翅突变表型紧密连锁.这些都说明.scaleless的Bm-ASH2基因因启动子突变而使其不能正常转录和表达.利用瞬时表达系统使Bm-ASH2基因在scaleless早期蛹翅中表达,可以使翅面鳞片明显增多,进一步说明Bm-ASH2是家蚕翅面鳞片产生的关键因子.从而初步阐明了家蚕无鳞片翅突变体scaleless产生的分子机理.