论文部分内容阅读
前言: 胰腺癌是恶性程度最高的消化道恶性肿瘤之一,疾病进展快,中位生存期短,5年生存率不超过5%,长期生存率低于15%,是全球第八位肿瘤相关死亡原因[1,2]。其发病缺乏早期的临床表现,确诊时往往已属中晚期。胰腺癌对放化疗等目前的综合治疗方法不敏感,预后差,易复发,又被称为“癌中之王”。但目前胰腺癌增殖调控的分子机制尚未完全明确,所以,开发以针对胰腺癌新型分子靶向治疗方法可能为改善胰腺癌患者预后提供重要实验依据。 在前期研究中,利用BOP诱导的叙利亚仓鼠实验性胰腺癌模型,建立了非解离型低转移株胰腺癌细胞系(PC-1),再将PC-1细胞经尾静脉种植仓鼠体内,取转移癌建立了解离型高转移株胰腺癌细胞系(PC-1.0),而这两种同源细胞具有明显不同的增殖能力。我们近期对MAPK信号转导通路的研究证实MEK1密切参与调控胰腺癌细胞的增殖调控。 miRNA作为一种非编码RNA可与下游靶mRNA的3‘-非翻译区相结合,调节靶基因的表达。一种miRNA往往可以调控多个靶基因,一个靶基因又可以被多种miRNA所调控,在调控过程中,多条信号通路交叉形成复杂的网络。miRNA通过一系列调控机制,参与细胞的生长、增殖、分化、凋亡和上皮间质转化等生物学行为。miRNA作为一种调控因子,可通过影响肿瘤细胞的生物学行为在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。 在前期研究中利用miRNA microarray筛选出包括miR-193a-3p在内的解离型高转移胰腺癌细胞PC-1.0和非解离型低转移胰腺癌细胞PC-1中差异表达的miRNA,其中在PC-1.0细胞中表达上调的miRNA14个,表达下调miRNA7个。miR-193家族包括miR-193a-3p、miR-193a-5p和miR-193b,有文献报道miR-193a-3p抑制乳腺癌细胞周期进程及增殖[11],另有报道称其参与抑制甲状腺癌细胞生长,Kwon JE等研究发现miR-193a-3p在胶质瘤细胞系U-251和HeLa细胞系中抑制细胞增殖并促进凋亡。Wang HB等发现在肺癌中低表达,另外还有研究发现miR-193a-3p参与结直肠癌、前列腺癌和肝细胞癌的发生发展,到目前为止,miR-193a-3p在胰腺癌细胞中的生物学功能尚未见文献报道。 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导通路几乎存在于所有真核生物细胞中,为三级激酶体系:MAPK,丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAP kinase kinase,MKK或MEK)和丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP kinase kinase kinase,MAPKKK)。MEK1是MEK家族的重要成员,MEK1作为MAPK信号转导通路中的重要激酶分子,参与了多数细胞的生理和病理学进程,包括细胞增殖、分化,细胞分裂,应激和细胞凋亡等。但胰腺癌细胞增殖调控中miR-193a-3p的作用及其与信号转导通路的相互关系尚未见文献报道。 目的: 在本研究中拟利用Realtime-PCR、细胞转染及miRNA功能解析方法检测miR-193a-3p在各种增殖能力不同的胰腺癌细胞中的表达并探讨miR-193a-3p参与胰腺癌细胞增殖调控的分子机制。 材料与方法: 一、材料 采用非解离型低转移胰腺癌细胞PC-1及Capan-2细胞和解离型高转移胰腺癌细胞PC-1.0及Aspc-1细胞。PC-1细胞是利用BOP诱导的叙利亚仓鼠实验性胰腺癌模型建立。PC-1.0细胞是由同系仓鼠尾静脉注射PC-1细胞后产生的肿瘤而建立。上述两种细胞系具有不同的增殖能力。PC-1细胞培增时间为24h,PC-1.0倍增时间为12h。Aspc-1细胞在增殖能力方面类似PC-1.0细胞,而Capan-2细胞类似PC-1细胞。此外,还选用了在前期研究中建立的PC-1.0 MEK1基因敲减胰腺癌细胞。 本实验中应用miR-193a-3p inhibitor和mimics均由Life techonology公司设计合成,miR-193a-3p探针及U6由Life techonology公司设计合成,载体RNAiMAX购自Life techonology公司。miRNA提取试剂盒购自Life techonology公司。 二、方法 通过realtime-PCR验证miR-193a-3p在具有不同增殖能力的胰腺癌细胞中的表达。解离型高转移胰腺癌细胞转染miR-193 a-3p inhibitor,非解离型低转移胰腺癌细胞转染miR-193 a-3p mimics,并通过CCK-8细胞增殖实验、PI凋亡实验、Transwell侵袭实验和细胞形态学探讨miR-193a-3p在具有不同增殖能力的胰腺癌细胞中的作用机制。 实验结果: 一、验证miR-193a-3p在胰腺癌细胞中的表达 为验证前期研究miRNA microarray的实验结果,本实验利用Realtime-PCR进一步验证在解离型高转移胰腺癌细胞(PC-1.0和Aspc-1)以及非解离型低转移胰腺癌细胞(PC-1和Capan-2)中的miR-193a-3p的表达。结果证实miR-193a-3p在PC-1.0和PC-1细胞中的表达与前期mIRNA microarray的结果一致,PC-1.0细胞中miR-193a-3p的表达较PC-1细胞上调(P<0.05)。在与上述细胞增殖特性相似的人胰腺癌细胞Aspc-1和Capan-2中,miR-193a-3p表达同样为Aspc-1中较Capan-2中表达上调(P<0.05)。 二、miR-193a-3p抑制剂及激动剂转染胰腺癌细胞的转染效率 转染miR-193a-3p inhibitor24h后,PC-1.0细胞中miR-193a-3p表达抑制率为98.6%(P<0.05),Aspc-1细胞中抑制率为89.3%(P<0.05);转染miR-193a-3pmimics24h后,PC-1细胞中表达增强101%(P<0.05),Capan-2细胞中表达增强353%(P<0.05)。 三、miR-193a-3p的生物学功能解析 (一)解离型高转移胰腺癌细胞转染miR-193a-3p inhibitor(抑制实验) 转染miR-193a-3p inhibitor后明显抑制了解离型高转移胰腺癌增殖能力,在凋亡和细胞形态学方面作用不显著。 (二)非解离型低转移胰腺癌细胞转染miR-193a-3p mimics(激动实验) 转染miR-193a-3p mimics后非解离型低转移胰腺癌细胞的增殖能力明显增强,PC-1细胞的体外侵袭能力被抑制,胰腺癌细胞的凋亡和细胞形态学方面无明显变化。 四、miR-193a-3p与MAPK信号转导通路的关系 利用前期研究中建立的PC-1.0 MEK1基因敲减胰腺癌细胞,通过Realtime-PCR检测miR-193a-3p的表达变化。结果显示PC-1.0 MEK1基因敲减胰腺癌细胞中miR-193a-3p的表达较对照细胞明显下调(P<0.05)。 结论: 1、miR-193a-3p在解离型高转移株胰腺癌细胞和非解离型低转移株胰腺癌细胞中的表达存在明显差异。 2、miR-193a-3p参与调控胰腺癌细胞的增殖。 3、miR-193a-3p可能通过参与MEK1介导的信号转导通路调控胰腺癌细胞增殖。