论文部分内容阅读
外源性胃泌素,如G17、甘氨酸衍生性G17、前胃泌素和内源性胃泌素均可促进胃肠癌细胞的增殖。除了在胃腺癌的发展中,胃泌素也在其他一些类型肿瘤(尤其是神经内分泌肿瘤)的发病机制里起了关键的作用。因此,越来越多的证据证明胃泌素不仅影响肿瘤的发展,它也将可能成为潜在的各种胃瘤样病变的治疗靶点。
RegⅠ是Reg基因家族的一员,是胃泌素的一个转录目标基因。RegⅠ既存在于正常胃粘膜细胞,也存在于胃腺癌癌组织细胞内。近几年的研究发现,胃癌组织RegⅠ蛋白的表达高于正常胃粘膜组织。利用Northern blot技术、原位杂交和免疫组织化学技术分析,RegⅠ基因在胃腺癌的阳性表达占35％。浸润性胃癌的癌组织较局限性癌的癌组织RegⅠ的表达水平高,而且患者预后调查中发现RegⅠ阳性表达的患者差于RegⅠ阴性患者。
低分化型胃癌RegⅠ蛋白表达比高分化型胃癌表达高,浸润型胃癌RegⅠ蛋白比原位型胃癌表达高,RegⅠ基因的表达与胃腺癌的浸润生长及分化有着密切关系。
胃泌素促胃癌细胞增殖的过程中,RegⅠ具有什么样的作用?RegⅠ主要在肠嗜铬样(enterochromaffin-lik celle,ECL)细胞中表达。RegⅠ在ECL细胞中的分泌,其中一方面是由于胃泌素的刺激。慢性高胃泌素血症患者,Reg蛋白表达增加并伴随了胃粘膜细胞的增殖。胃粘膜细胞的增殖呈现出对胃泌素剂量和时间依赖性。胃泌素对胃黏膜细胞的生长并无直接的生长刺激效应,而是通过刺激Reg蛋白表达来刺激胃粘膜细胞的生长。近几年人们开始对其在胃肠道组织内的表达及功能展开研究,RegⅠ在肿瘤发生发展中的作用逐渐被重视,但其作用机制目前仍在进一步研究中。
本研究构建了3个PegⅠ-shRNA表达载体,分别转染胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901,G418筛选；应用RT-PCR技术筛选建立了两个RegⅠ表达抑制的胃癌细胞系(BGC-823和SGC-7901)。应用MTT技术检测胃泌素和RegⅠ-shRNA表达载体对胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901增殖的效应,探讨RegⅠ在胃泌素促胃癌细胞增殖通路的作用。
方法：
1.构建PegⅠ-shRNA表达载体根据RegⅠ基因在GenBank中所查到的mRNA序列,通过在线设计和同源性比较确定3条靶向RegⅠ的siRNA序列,并合成互补性发卡样寡核苷酸。退火形成双链后,插入pSUPER-EGFP-Ⅰ质粒,构建3个RegⅠ-shRNA表达载体:pSUPER-EGFP-REG/14、pSUPER-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3。HindⅢ/EcoRⅠ双酶切及序列分析鉴定。
2.梯度浓度胃泌素对胃癌细胞增殖的效应应用10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6mol/L和10-5 mol/L的胃泌素G17孵育胃癌细胞系SGC-7901及BGC-823,分别于24h、48h和72h后,应用MTT技术检测胃泌素对胃癌细胞增殖效应,筛选出胃泌素对细胞增殖最有效的作用浓度和作用时间。
3.转染及筛选转染前胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901的培养体系采用无抗生素培养基。各质粒提取均采用无内毒素质粒提取试剂盒。分实验组(转染质粒pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3)、实验对照组质粒(转染质粒pSUPER-EGFP-Ⅰ)和对照组(无质粒转染)。应用脂质体LipofectamineTM2000转染,G418选择性筛选近3周。RT-PCR技术检测RegⅠ mRNA水平,建立RegⅠ基因表达抑制的BGC-823细胞系和SGC-7901细胞系。
4.胃泌素孵育对RegⅠ基因表达抑制细胞系的增殖效应采用最佳胃泌素孵育的浓度和时间段孵育RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞胃癌细胞系BGC-823细胞系和SGC-7901细胞系,应用MTT技术比较孵育前后胃癌细胞增殖变化。
5.统计学处理所有结果以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS11.5统计软件处理数据,采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有显著性。
结果：
1.RegⅠ-shRNA表达载体构建酶切及测序鉴定,插入片段正确,3个shRNA表达载体,pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3构建成功。
2.胃泌素孵育最佳浓度及时间 MTT结果显示,胃泌素对胃癌细胞的促增殖效应具有浓度和时间依赖性；浓度10-5 mol/L,作用时间72h,胃泌素G17对胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901的促增殖效应最佳。
3.RT-PCR结果 RegⅠ和β-aetin扩增的片段分别为281 bp和389 bp。pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2、pSUPER-EGFP-REG/3、pSUPER-EGFP-Ⅰ和对照组的RegⅠ/β-actin灰度比值的均值分别为0.288±0.067、0.947±0.048、0.873±0.084、0.972±1:0.016和0.984±0.013(BGC-823),0.400±0.152、0.9934±0.021、0.913±0.034、0.968±0.014和0.972±0.014(SGC-7901)。转染pSUPER-EGFP-REG/1的BGC-823和SGC-7901细胞RegⅠ mRNA水平均明显降低(P<0.05)。结果表明,转染pSUPER-EGFP-REG/1表达载体的胃癌细胞系为RegⅠ基因表达抑制细胞系。
4.MTT结果
胃癌细胞系BGC-823
RegⅠ基因表达抑制胃癌细胞系BGC-823的增殖效率(0.779±0.015)明显低于对照组胃癌细胞BGC-823(0.9764±0.010)(P<0.05)。胃泌素孵育后,胃癌细胞BGC-823的增殖效率(0.924±0.015)明显增加(P<0.05)；而RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系增殖效率(0.789±0.223)与孵育前比较无明显改变(P>0.05)。
胃癌细胞系SGC-7901
RegⅠ基因表达抑制胃癌细胞系SGC-7901的增殖效率(0.773±0.008)明显低于对照组胃癌细胞SGC-7901(0.915±0.028)(P<0.05)。胃泌素孵育后,胃癌细胞SGC-7901的增殖效率(0.975±0.009)明显增加(P<0.05)；而RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系增殖效率(0.776±0.006)与孵育前比较无明显改变(P>0.05)。
结论：
1.成功建立了RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系。
2.胃泌素对胃癌细胞的促增殖效应具有时间与浓度依赖性。
3.RegⅠ基因可能是胃泌素促胃癌细胞增殖通路的关键下游基因。