论文部分内容阅读
背景与目的神经系统原发性损害或功能障碍所引起的异常痛觉、自发性疼痛、痛觉过敏的现象,称为神经病理痛。神经病理痛患病率高,患者生存质量差,治疗效果不满意。至今神经病理痛的发生机制尚不完全清楚,机械损伤、神经的代谢或营养性改变、病毒感染或放疗的神经毒性、缺血性神经损害、神经递质功能障碍均可导致神经病理痛。目前,疼痛的治疗方法主要是通过局麻药、抗抑郁药、中枢性抑制药、抗癫痫药等,疗效短暂、副作用大,且易产生药物依赖。近期的研究表明,电压门控钠离子通道Ⅸα亚基(Nav1.7,SCN9A编码)可能与三种痛觉异常性疾病即肢端红痛症、阵发性剧痛症、先天性无痛症密切相关。其中Nav1.7功能错义突变引起肢斑红痛症和阵发性剧痛症,Nav1.7无义突变引起先天性无痛症。电压门控钠离子通道Nav1.7主要表达在DRG和交感神经节中。DRG中表达各种各样的钠、钾离子通道。这些离子通道包括转换、传导神经信号、调节突触的运输三大功能。神经受伤后,受损或者未受损的神经元均会出现异常的放电活动,这种异常放电是否是Nav1.7的异常表达所引起的?因此,我们设计以下实验,并希望通过对Nav1.7表达的干预来治疗神经病理痛提供实验数据。本研究通过建立SNL神经病理痛模型和原代培养DRG神经元细胞,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激神经元细胞;构建慢病毒,体内、外实验两个方面感染慢病毒介导的siscn9a(lv-siscn9a),观察行为学及钠离子通道nav1.7的变化,阐明nav1.7在神经病理性疼痛中的作用,为神经病理性疼痛的转基因治疗提供重要的理论和实验基础。方法1.构建慢病毒介导的siscn9a,培养pc12,感染慢病毒后并进行滴度测定。2.用tnf-α刺激体外培养出生21d的sd大鼠drg神经元细胞,通过免疫组化及western-blot检测nav1.7的表达情况。慢病毒介导的siscn9a分别感染有和无tnf-α刺激的神经元细胞,western-blot检测各个组别中nav1.7的表达情况,免疫荧光检测慢病毒的感染效率。3.制作snl神经病理痛模型,行为学检测术前1d,术后3,7,10,14,21d大鼠机械痛阈值和热缩足阈值的变化,免疫荧光双标和western-blot检测各组中术后7d时nav1.7的变化,统计nav1.7的灰度值。4.drg微量注射2μl的lv-siscn9a和lv-sc。行为学检测机械痛阈值和热缩足阈值,免疫荧光双标和western-blot检测各组中nav1.7的变化,并统计nav1.7的灰度值。免疫荧光检测大鼠脊髓背角中cgrp的表达情况,并统计cgrp的荧光强度。结果1.构建的慢病毒介导的sirna的基因测序为acagcatgatctgcttgttcc与目标基因scn9a的cds区的5084-5104碱基序列完全配对,慢病毒介导的sirna感染培养的pc12细胞选用的moi=10可以满足我们的实验需要。检测慢病毒的滴度为6×108。2.体外原代培养的神经细胞用100ng/mltnf-α刺激westernblot结果显示与对照组相比,tnf-α组的nav1.7蛋白表达增加,`x±s分别为(0.78±0.07、0.34±0.04);p=0.013;免疫荧光显示病毒携带的gfp在神经细胞内表达,lv-siscn9a感染神经元细胞后感染效率达到80%左右。与lv-sc组相比,lv-siscn9a感染原代培养的神经元后可以抑制tnf-α刺激引起的nav1.7的高表达`x±s分别为(0.26±0.05、0.73±0.08);p=0.02。3.制作snl神经病理痛模型,与sham组相比,snl组大鼠术侧的痛敏阈值(13.5±0.9到2.3±0.6)、热缩足阈值(13.7±1.2到8.5±0.4)均降低,p=0.03;SNL模型建立成功;免疫荧光显示SNL术后3d Nav1.7表达明显增高(0.20±0.03到0.8±0.07);p=0.002。4.SNL模型DRG注射LV-siSCN9A与注射LV-SC组相比,SNL大鼠术侧机械痛敏阈值(5.7±0.5到10.5±0.6)和热痛敏阈值(7.9±0.3到13.5±0.7)均升高。Western blot显示术后7d SNL+LV-siSCN9A组与SNL+LV-sc组相比Nav1.7的表达降低(0.5±0.04、0.8±0.05);p=0.03。免疫荧光可以实现GFP与Nav1.7的共标;结论LV-siSCN9A感染神经元可有效下调TNF-α刺激和SNL神经病理痛模型引起的Nav1.7的高表达,从而缓解神经病理痛。