结肠癌与结肠癌干细胞的研究背景结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,随着我国国人生活水平的提高、饮食生活习惯的改变,结肠癌在我国的发病率呈明显的上升趋势。随着辅助化疗药物的进步和多学科协作治疗的发展,近年来结肠癌的生存率有明显的提高,但远处转移和复发仍然是结肠癌致死的主要原因。因此,要根本提高结肠癌的诊治水平,就必须对其发生机制进行深入研究。近年来,越来越多的学者认为癌症是肿瘤干细胞引发的疾病,对肿瘤干细胞的研究进一步加深了人们对肿瘤发生、发展的认识。肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的少部分具有干细胞性质的细胞群,具有自我更新能力和不确定分化程度的潜能,是肿瘤形成和不断生长扩散的根源。目前已在多种实体肿瘤和血液系统肿瘤(如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、皮肤癌、胰腺癌、白血病、恶性胶质瘤等)分离和筛选出各自肿瘤干细胞,充分说明肿瘤干细胞是恶性肿瘤中普遍存在的现象。肿瘤发生是一个多因素、多步骤的过程,细胞信号转导通路的异常和紊乱在其中扮演至关重要的角色。人体内细胞信号转导通路众多,涉及到配体、受体、细胞内信号蛋白和核内信号蛋白等多个环节,构成了一套极为复杂的网络,并且具有非常精细的调控机制。肿瘤干细胞的发生、发育受到Notch、Wnt/β-catenin、 Hedgehog、Bmi-1、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)等信号通路的严格控制,以上信号通路的异常激活和失常会促进肿瘤干细胞的形成和肿瘤发生。CCND1 和 E2F3的研究背景Cyclin是周期素,同周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)、和周期素依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinases inhibitors, CKIs)一起对细胞周期起到调控作用,周期素含量随细胞周期而变化,不同的周期素在其相应周期时相达到含量和活性的高峰,激活相应的CDKs,随后迅速降解失活,从而起到对细胞周期的调控作用。其中,cyclin D1作为细胞周期调节因子之一,其过度表达是多种人类原发性肿瘤的特征,对肿瘤的诊断和预后判断具有重要意义。cyclin D1蛋白表达增加主要见于一些原发性恶性肿瘤,例如头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌、食管癌和肝细胞癌。E2F转录因子是细胞周期中G1期进入S期的重要调控因子。同时,E2F因子与肿瘤的发生和细胞凋亡有着紧密的关系。E2F的靶基因包括细胞DNA合成及细胞周期进程的限速调解剂、原癌基因及肿瘤抑制基因等。研究证明,E2F在多数组织中发挥癌基因作用,如E2F过度表达可促使p53缺失小鼠皮肤肿瘤的形成,在前列腺癌、乳腺癌等组织也有E2F的异常表达。microRNA的研究背景和与肿瘤干细胞的相关性MicroRNA是一类单链非编码小分子RNA,通过完全/不完全与靶基因mRNA 3’-非翻译区互补结合,剪切、降解靶基因mRNA,抑制靶基因mRNA的翻译,从而对靶基因进行转录后表达的调控,调节多种病理生理过程,如干细胞分化、细胞增殖和肿瘤形成,并且某些nicroRNA与肿瘤干细胞的自我更新和多向分化存在紧密联系。研究人员从小鼠肺组织中成功分离出肿瘤干细胞,提示microRNA调控肿瘤干细胞的分化、侵袭、凋亡等多种功能。此夕,microRNA尚通过基因调控作用调节肿瘤干细胞的生物学功能。因此,microRNA作为一种新的调控基因表达的小分子RNA,已成为研究肿瘤干细胞信号转导调控的新途径。研究目的本课题拟通过Real time-PCR、基因转染、荧光素酶系统验证、基因芯片等分子生物学手段,探寻miR-449b在结肠癌干细胞中的差异表达和变化,并通过生物信息学方法挖掘和确证其相应的靶基因,建立结肠癌干细胞生物发育的特异信号调控通路。通过这些方面的深入研究,有助于揭示结肠癌干细胞发生发育学的：microRNA信号转导调控机制,为大肠癌防治提供新的治疗靶点和策略。研究方法(1)首先进行结肠癌干细胞的分选和鉴定。根据目前公认的结肠癌干细胞表面分选标志CD133分子和CD44分子,通过流式细胞仪分离筛选结肠癌细胞株中CD133+CD44+双阳性肿瘤干细胞和CD133-CD44-双阴性细胞。采用流式细胞术、Western-blot等方法,对结肠癌肿瘤干细胞的特性进行鉴定。(2) microRNA在结肠癌干细胞中的差异表达确证。对分离的结肠癌干细胞进行扩增：无血清培养技术扩增获取结肠癌干细胞。对两组CD133+CD44+双阳性肿瘤干细胞和CD133-CD44-双阴性细胞的总RNA的提取。并利用1microRNA芯片比较CD133+CD44+双阳性肿瘤干细胞和CD133-CD44-双阴性细胞的microRNA表达谱。挑选出有意义的差异表达的microRNA。(3)综合mRNA数据库、microRNA数据库、生物信息学技术分析预测候选miR-449b的靶基因mRNA。利用基因芯片比较CD133+CD44+双阳性肿瘤干细胞和CD133-CD44-双阴性细胞的mRNA表达谱。对差异基因数据进行基因本体论(Gene Ontology, GO)分析、信号通路(Pathway)分析、Path-Net的构建、动态基因关系网络(Dynamic-Gene-Net)的构建。对差异microRNA进行STC分析、GO分析、Pathway分析、Path-Net的构建。差异microRNA进行靶基因的预测,预测靶基因的数据库：TargetScan。差异microRNA预测的靶基因与差异基因取交集,microRNA和靶基因的负相关分析。(4)利用pMIR-REPORTTM microRNA表达荧光素酶(luciferase)报告系统验证差异表达的microRNA:靶mRNAs相互作用靶位点。(5)利用microRNA抑制剂及pre-microRNA、表达载体转染,进行microRNA分子功能的阻断和／或再现,研究结肠癌干细胞差异表达microRNA--CCND1、E2F3通路分子的表型改变,解析差异表达rnicroRNA--CCND1、E2F3通路调控结肠癌干细胞的增殖分化功能。结果(1)我们通过使用公认的结肠癌干细胞表面分选标志CD133分子CD44分子筛选出结肠癌细胞株中CD133+和CD44+双阳性肿瘤干细胞和CD133-和CD44-双阴性细胞。对肿瘤干细胞在无血清培养扩增后的表面分子CD133和CD44进行了验证,发现我们分选的结肠癌干细胞表面CD133和CD44分布集中、表达水平高,我们对干细胞的公认的干性表达指标Bmil和Oct4进行了确证,发现在我们分选的结肠癌干细胞中Bmil和Oct4的表达水平显著增高(p<0.05)。(2)我们通过microRNA和mRNA表达谱芯片比较CD133+和CD44+双阳性肿瘤干细胞和CD133-和CD44-双阴性细胞的microRNA表达谱和mRNA表达谱,我们发现各有31个nicroRNA的表达值显著升高和显著降低,各有14个mRNA的表达值升高10倍以上或值降低10倍以上。并且确证了差异表达的miR-449b、 miR-29a、miR-29b等的表达水平(p<0.05),确证了差异表达的基因NRAS、FOS、WASF2、COL5A1、CDK6、CCND1等的表达水平(p<0.05)。(3)使用人类基因数据库、microRNA数据库、生物信息学技术(KEGG等)分析,通过计算机分析发现在结肠癌干细胞与非干细胞中有 mi-29a、miR-29b、miR-4524、miR-449b和miR-31等处于关键的调控网络枢纽性地位(p<0.05)。并且建立了差异microRNA与差异表达mRNA之间的GO分析、Pathway分析、Path-Net图。(4)根据生物信息学分析的结果,我们使用荧光素酶报告系统验证了miR449b与CCND1和E2F3之间的相互作用的关系。我们发现只有在miR-449b 与 CCND1和E2F3的非突变体的实验组中,荧光值下降明显(p分别为0.019和0.013)。(5)验证了miR-449b通过作用于CCND1和E2F3靶点,调节结肠癌干细胞自我更新的功能,我们使用MTT实验测定miR-449b对结肠癌干细胞自我更新能力的调控能力。我们发现在miR-449b高表达组,结肠癌干细胞的MTT值明显下降(p=0.010)。我们使用流式细胞仪检测细胞周期的改变,我们发现在miR-449b高表达组停滞在细胞周期的G0-G1阶段的细胞数目增加,处于S期的细胞数目减少。我们检测与CCND1和E2F3相关的细胞周期相关蛋白,发现P53和CDK4在miR-449b高表达组分别表现为增高和降低,在miR-449b低表达组有相反表达趋势。总的来说,miR-449b通过抑制CCND1和E2F3基因的表达对结肠癌发生、发展起着抑癌基因的作用。结论(1)miR-449b在结肠癌干细胞系内的表达水平下调,这一实验结果之前罕有文献报道。(2)绘制了结肠癌干细胞差异表达microRNA与靶基因关系图,提示了结肠癌干细胞中包括细胞周期,能量代谢,细胞膜连接等多种功能表达相关的差异。(3)miR-449b对结肠癌干细胞的自我更新起到抑制作用,提示miR-449b分子在结肠癌发病中起着抑癌基因的作用。(4)miR-449b通过作用于E2F3和CCND1,下调两个基因在结肠癌干细胞中的表达水平。(5)miR-449的作用靶标E2F3和CCND1以及其下游分子是细胞增殖调节通路的重要组成部分,miR-449b可能通过抑制肿瘤干细胞的自我更新而发挥其抑癌基因的作用。