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背景:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染已成为一个严重的公共卫生问题,全球约有2.57亿HBV感染者,且每年约有78.6万人因HBV感染相关性肝脏疾病而死亡。HBV感染的临床结局主要由宿主免疫应答和病毒之间的相互作用来决定。适应性免疫,尤其是HBV特异性的细胞毒性的T淋巴细胞和CD4+T细胞的免疫反应是控制HBV感染的关键因素,然而,慢性HBV(chronic hepatitis B,CHB)感染患者体内并不能产生这种有效的适应性免疫应答。CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)是机体重要的免疫调节细胞,通过抑制效应性T细胞的功能,而在病毒免疫耐受机制中起重要作用。大量研究证实CD4+CD25+ Tregs与HBV感染慢性化有关。叉头框蛋白3(forkhead box protein,Foxp3)是CD4+CD25+Tregs特异性表达的转录因子,也是运用最广泛的Tregs定义分子标志物,其在Tregs发育、分化和功能维持等方面起重要作用。研究发现CHB患者CD4+ T细胞中Foxp3表达升高,并与Tregs数量呈正相关,参与了HBV感染慢性化过程。目前,CHB患者CD4+T细胞中Foxp3基因的表达调控机制仍不清楚。表观遗传学调控在细胞发育和分化过程中起重要的作用,多个研究表明Foxp3基因的DNA甲基化状态对维持CD4+CD25+ Treg细胞中Foxp3的稳定表达及Tregs表型发挥了重要的作用。Foxp3基因DNA发生高甲基化可抑制Foxp3表达,而低甲基化可稳定Foxp3表达。因此,我们推测CHB患者的CD4+T细胞中Foxp3基因可能发生了去甲基化,并导致了其表达的上调,从而导致慢性HBV感染的持续存在。目的本研究旨在探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者CD4+T细胞中叉头框蛋白3(Foxp3)基因的甲基化状态及其作用。方法收集了 59例CHB患者和22例健康对照者(healthy controls,HC)的外周静脉血,使用流式细胞仪检测外周血CD4+ T细胞中CD4+CD25+Foxp3+ Tregs的比例。分别采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和免疫印迹法(Westren blot)检测 CD4+T 细胞 Foxp3基因的转录水平和蛋白表达水平,甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)检测 CD4+ T 细胞Foxp3基因的甲基化状态。结果1.CHB 患者 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例(4.6%[3.2%,6.4%])显著高于 HC 组(3.6%[2.75%,4.3%])(P<0.05),且 HBeAg 阳性患者 CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例(5.30%[3.73%,7.98%])均明显高于 HBeAg 阴性患者(3.90%[3.10%,4.90%])和HC(3.6%[2.75%,4.3%])(P值均<0.05),然而HBeAg阴性患者与HC之间差异无统计学意义(P>0.05)。2.CHB患者外周血CD4+T细胞中Foxp3基因mRNA转录水平(0.0032[0.0019,0.0069])和蛋白表达水平(0.59[0.4,0.93])均显著高于HC组(0.0017[0.0015,0.0030];0.45[0.37,0.55])(P 值均<0.05),HBeAg 阳性 CHB 患者外周血CD4+T细胞中Foxp3基因mRNA转录水平(0.0046[0.0040,0.0061])和蛋白表达水平(0.73[0.66,0.93])均显著高于HBeAg阴性CHB患者(0.0024[0.0022,0.0041];0.49[0.41,0.66])和 HC 组(0.0017[0.0015,0.0030];0.45[0.37,0.55])(P 值均<0.05),HBeAg 阴性 CHB 患者 mRNA 水平也明显高于HC组(P<0.05),然而,HBeAg阴性CHB患者与HC之间Foxp3蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05)。此外,Spearman等级相关性检验发现CHB患者CD4+T细胞中Foxp3的表达水平与CD4+CD25+Foxp3+ Tregs细胞的比例呈正相关。3.CHB 患者 Foxp3enc 和 Foxp3cpg 的甲基化频率(Foxp3enc 42.4%;Foxp3cpg 37.3%)均显著低于 HC 组(Foxp3enc 72.7%;Foxp3cpg 63.6%)(P 值均<0。05),且 HBeAg 阳性 CHB 患者 Foxp3 基因增强子(Foxp3enc)和 CpG 岛(Foxp3cpg)的甲基化频率(35.3%;32.4%)均显著低于HC组(72.7%;63.6%)(P值均<0.05)。然而,HBeAg 阴性 CHB 患者 Foxp3enc 和 Foxp3cpg 甲基化频率(52.0%;44.0%)与HBeAg阳性CHB患者和HC组之间均无显著性差异(P>0.05)。此外,CHB患者中Foxp3基因甲基化组的mRNA水平和CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例均显著低于未甲基化组(P<0.05)。4.血清 HBV DNA 高载量(HBV DNA>1000 IU/ml)的 CHB 患者 CD4+ CD25+ Foxp3+Tregs 比例(5.00%[3.80%,7.60%])和 Foxp3 mRNA 表达水平(0.0037[0.0024,0.0080])均显著高于血清HBV DNA低载量(HBV DNA<1000 IU/ml)的CHB患者(3.70%[2.95%,5.08%];0.0024[0.0017,0.0038])(P<0.05)。然而,血清HBV DNA高载量的CHB患者Foxp3的甲基化频率并不显著低于血清HBV DNA低载量的患者(Foxp3enc 34.3%vs 56.5%,P = 0.129;Foxp3cpg 31.4%vs 45.8%,P>0.05)。结论CHB患者CD4+T细胞中Foxp3基因存在异常去甲基化,可能促进了 Foxp3的表达升高,进而引起CD4+25+Foxp3+Tregs比例的增加而导致HBV感染的慢性化,这为慢性乙型肝炎的防治提供了新的方向和思路。