不动杆菌属(Acinetobacter spp.)是非发酵条件致病菌,通常在机体抵抗力降低时引起感染,是院内感染的重要机会致病菌之一,其中鲍曼不动杆菌生命力尤其顽强,可广泛分布于医院环境之中。近年来,随着临床上广谱抗生素的大量应用,出现了对大部分抗生素耐药的多重耐药及超耐药鲍曼不动杆菌,并时常造成院内感染的暴发流行,给临床治疗带来极大挑战。特别是,随着产NDM-1超耐药菌的出现与流行,全球已对抗生素滥用问题及细菌耐药问题产生极大关注。本研究基于军队传染病病原监测平台,2010~2014年间,本实验室在我国北京、沈阳、苏州、甘肃、厦门、南京等不同地区,收集300株来自临床病人、医院环境的疑似不动杆菌属细菌,利用16S r RNA测序技术对其进行检测,共确认不动杆菌均属细菌292株,其中鲍曼不动杆菌251株、醋酸钙不动杆菌19株、琼氏不动杆菌19株、洛菲不动杆菌3株,苏州地区分离117株、沈阳117株、甘肃33株、北京12株、济南2株,厦门3株、广州4株、南京4株。为了解我国不动杆菌属细菌的耐药特点,本研究对实验室现有的226株细菌进行了抗生素敏感性试验。药敏结果显示,来自北京、沈阳、苏州3个地区的不动杆菌属细菌,对临床上8种首选治疗鲍曼不动杆菌感染药物产生了不同程度的耐药。耐药率从高到低依次为头孢他啶96%、诺氟沙星/头孢吡肟92%、亚胺培南88%、头孢哌酮87%、哌拉西林84%、替卡西林/克拉维酸83%、阿米卡星77%。此外,多重耐药不动杆菌共有211株、占测试菌株的97%,其中北京7株、占总数的3%,沈阳94株、占总数的45%,苏州110株、占总数的52%。在这些多重耐药不动杆菌属细菌中,有150株菌对5类以上抗生素全部耐药,其中沈阳57株、苏州93株。以上结果表明,我国医院内流行的不动杆菌属细菌耐药情况目前十分严重。同时还可以发现,这些耐药不动杆菌对内酰胺酶抑制剂和氨基糖苷类药物的敏感性也比较高。所以,在临床上可以考虑使用以上两类药物治疗由不动杆菌属细菌引起的感染,对已产生耐药的药物应暂停使用,避免造成更严重的耐药后果。为进一步探究我国不同地区不动杆菌的遗传多态性及亲缘关系,本研究利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法,对292株不动杆菌属细菌进行分子分型分析,显示出较好的分型性、分辨力和重复性,能够将病原体的流行病学相关性准确地反映出来。使用Bio Numeries软件对电泳成功的267株不动杆菌属细菌进行聚类分析,按63%的cutoff值,可分成52个聚类群、共170种PFGE型别,相似性介于25%~100%之间。以上表明,我国不动杆菌属细菌具有较高的遗传多态性,存在多种不同型别的不动杆菌属细菌的流行。其次,有一组数据显示沈阳1株菌和甘肃1株菌的PFGE带型相同,另一组数据显示沈阳2株、甘肃4株、苏州1株菌共7株菌的PFGE带型相同,可见,在不同地区存在同一PFGE型别的菌株,可能是同一克隆不动杆菌属细菌在不同地区之间的传播。通过实验结果发现,甘肃地区医院的ICU病房有9株菌PFGE带型相同,同时ICU病房发现的9株菌与该医院呼吸内科分离的2株菌PFGE带型形相同。以上表明,在医院同科室内流行的不动杆菌属细菌存在着相同带型,并且可以通过交叉感染的方式流行于不同病房之间。目前产NDM耐药菌已经在全球范围内播散,成为严重威胁公共健康的“超级细菌”。为了解目前我国不动杆菌属细菌产NDM菌株的流行情况,本研究利用PCR扩增方法对实验室在2010年至2014年期间收集自厦门、北京、广州、南京、济南、沈阳、苏州、甘肃等8个地区的共572株不动杆菌属细菌进行了bla NDM基因筛查,结果发现有45株菌为bla NDM阳性,占总数的8%,其中42株为产NDM-1菌株,北京地区产NDM-1阳性率最高,其中有7株产NDM-1不动杆菌分离自医院污水。此外,苏州地区还检出1株菌为NDM-5阳性。以往报道NDM-5多被检出于大肠杆菌中,在鲍曼不动杆菌中检出的报道还很少。特别值得关注的是,本实验还发现了2株鲍曼不动杆菌可能携带新型的bla NDM序列,其分别来自于厦门和北京,通过序列比对发现其第290位碱基由A变成C,导致其97位氨基酸由CAG变成CCG,即由谷氨酰胺(Gln/Q)变为脯氨酸(Pro/P)。从PFGE聚类图来看,这两株菌存在差异,其序列还有待于进一步验证确定。选择23株菌通过S1核酸酶-PFGE-Southern blot杂交法对bla NDM基因进行定位,发现有12株菌的bla NDM-1基因存在于质粒上,且大小相同,约为30-50kb。此外,本研究还对我中心实验室分离的国内首株产NDM-1不动杆菌XM1570进行了全基因组序列分析。我们发现XM1570序列与之前报道的A.calcoaceticus PHEA-2相近,并且其质粒p XM1上的bla NDM-1基因位于复合转座子Tn125内,该转座子包含两个插入序列ISAba125,分别位于bla NDM-1基因的上下游,且两者存在两个碱基的差异。Tn125经常与aph A6基因同时存在于质粒上,并位于aph A6基因的下游。质粒序列与目前国内外报道的携带bla NDM-1基因质粒序列相似性高。通过以上分析本研究获得了以下有意义的结果:1、根据药敏结果指导临床用药,制定合理的、有效的治疗方案;2、合理使用抗生素,有效降低多重耐药不动杆菌产生的几率。3、应用PFGE方法有助于发现菌株之间的遗传关系,找到传染源及时对其进行控制,防止不动杆菌引起院内感染的流行。4、北京地区NDM-1的菌株在医院污水内检出率高,医院应注意合理处置污水。5、发现了NDM新序列,暂定为NDM-15,NDM在我国流行过程中可能发生了变异,值得引起重视。6、我国流行的携带bla NDM-1基因的质粒多定位于细菌的质粒上。中国内首株产NDM-1不动杆菌的bla NDM-1基因定位于质粒上,并且该质粒具有较高的转移性,bla NDM-1基因极有可能通过接合作用扩散到其他强致病性的病原菌中,应加强临床产NDM细菌的监测。