量子点是指三维尺度均处在纳米量级(1～100nm)的材料。量子点由于其独特的光化学特性,已被广泛应用于光电领域和生物医学领域。随着量子点应用的增加,生物体接触到量子点的机会也越来越多。已有研究表明,多种量子点都具有体内和体外毒性作用,但是量子点的毒性受多种因素的影响,对于具体量子点的毒性需要进行个性化的评价。另外,量子点毒性作用的机制也尚无定论。肾脏作为量子点重要的排泄器官,肾小管上皮细胞可能受到量子点的损伤。因此,本研究选用研究尚不充分的硫化镉量子点,研究其对大鼠肾小管上皮细胞的毒性作用,并探讨其毒性作用的机制。目的本研究旨在采用分子生物学技术,研究硫化镉量子点(cadmium sulphide quantum dot, CdS QDs)对体外原代培养的大鼠肾小管上皮细胞(renal tubularepithelial cells, TECs)的毒性作用,并探讨其毒性作用的机制,为CdS QDs的安全应用提供依据。方法1.大鼠肾小管上皮细胞的原代培养采用机械分离结合酶消化法获取肾小管,原代及传代培养大鼠肾小管上皮细胞。2.硫化镉量子点对大鼠肾小管上皮细胞的毒性作用研究将处于对数生长期的细胞分别暴露于对照组(0.00)、2.50、10.00、20.00和40.00μg/mL的CdS QDs剂量组24h,观察不同剂量CdS QDs对TECs的形态学影响,并采用MTT实验检测CdS QDs(?)细胞存活率的影响。3.硫化镉量子点对大鼠肾小管上皮细胞的毒性机制的研究将处于对数生长期的细胞分别暴露于对照组(0.00)、2.50、10.00、20.00和40.00μg/mL的CdS QDs剂量组24h,采用生物化学法检测细胞内的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)含量。采用western blotting法检测CdS QDs寸细胞的过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物还原酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的蛋白表达的影响,实时定量PCR法检测细胞内CAT、GSH-Px和SOD mRNA的相对表达量,采用原子吸收光谱法(atomic absorption spectrometry, AAS)测定细胞内外的Cd2+浓度。结果1.大鼠肾小管上皮细胞的原代培养培养的细胞形态为多边鹅卵石样,体积较大,镜下透明度高,各细胞紧密相靠,互相衔接,融合成片,呈蜂窝状,符合大鼠肾小管上皮细胞的形态学特点。细胞免疫化学实验发现培养的细胞特异性表达的角蛋白-18,而不表达Ⅷ因子和结蛋白。综合形态学和细胞免疫化学实验的结果,可以判断培养的细胞是大鼠肾小管上皮细胞。2.硫化镉量子点对大鼠肾小管上皮细胞的毒性作用研究倒置显微镜下观察细胞形态发现,CdS QDs作用后的细胞附壁疏松、变圆、细胞体积减小。从10μg/mL组开始,细胞脱落增加,漂浮在培养液中,细胞死亡增加。在各剂量组加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸NAC (N-already usions amino acid in half),可增加细胞存活率。在10.00、20.00和40.00μg/mL剂量组,CdS单独作用和CdS+NAC联合作用24h后细胞存活率的差别有统计学意义。MTT实验结果显示,随着CdS QDs染毒剂量的增加,细胞存活率逐渐降低。2.50、10.00、20.00和40.00μg/mL剂量组的细胞存活率与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。3.硫化镉量子点对大鼠肾小管上皮细胞的毒性机制研究随着CdS QDs染毒剂量的增加,ROS、MDA和LDH含量升高,GSH含量下降,SOD、CAT和GSH-Px的蛋白和nRNA的表达量逐渐降低。与对照组相比,20.00μg/mL剂量组的SOD和CAT,以及40μg/mL剂量组的SOD、CAT和GSH-Px的蛋白和mRNA表达量降低,且差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。随着CdS QDs染毒剂量的增加,细胞内外Cd2+浓度均升高,到40.00μg/mL剂量组时,细胞内外Cd2+浓度均出现急剧上升。结论CdS QDs可以降低大鼠肾小管上皮细胞的存活率,抗氧化剂NAC对CdS QDs引起的肾小管上皮细胞损伤有部分保护作用。Cd2+的释放可能是CdS QDs细胞毒性的机制之一。另外,CdS QDs的细胞毒性作用可能与氧化损伤有关,其机制可能是CdS QDs通过减少抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px的nRNA的表达,降低细胞内SOD、CAT和GSH-Px的含量,引起机体的抗氧化损伤能力的下降,从而导致细胞损伤。