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糖尿病是临床常见的代谢性疾病,而血管病变则是其慢性并发症的主要表现,为糖尿病患者预后和生活质量的重要影响因素。多项研究表明,存在缺血性血管形成受损的糖尿病患者伴有视网膜的血管新生,即糖尿病视网膜病变(DR)。DR中的新生血管由于其功能不完善,从而引起玻璃体反复出血、纤维增生、视网膜脱离,最终发展为视力丧失。近年的研究发现,DR的新生血管与体内的某种干细胞密切相关,即内皮前体细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),又称为内皮祖细胞,是近年发现的能自我更新、增殖分化为内皮细胞的多能干细胞,与血管新生关系密切。大量的证据表明EPCs在血管形成中起重要作用,尤其在缺血条件下,Grant等研究发现骨髓来源的EPCs在成人视网膜血管新生的模型中起重要作用。有实验表明,NO也与糖尿病关系密切,糖尿病外周血中EPCs细胞数量减少可能与NO的减少有关,然而在DR中NO和EPCs与新生血管间的作用尚未见报道。本实验观察高浓度葡萄糖体外培养EPCs,旨在了解高糖与EPC增殖的关系及NO在其中的作用机制。我们从脐血成功分离出单核细胞,体外应用EPCs专用培养基EGM-2MV培养,倒置显微镜下观察细胞生长形态,免疫荧光染色鉴定细胞表面标志CD133、KDR、vWF的表达。体外培养的P2代细胞随机分为4组,即正常对照组:用EGM-2MV培养液培养;高糖组:葡萄糖终浓度为33mmol/L的EGM-2MV培养液;高糖+L-NAME组:含葡萄糖浓度为33mmol/L的EGM-2MV培养液中加入内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase,eNOS)抑制剂L-NAME10μmol/L;甘露醇组(渗透压对照组):含甘露醇的终浓度为33mmol/L的EGM-2MV培养液。四组细胞各培养48小时,采用倒置显微镜观察细胞生长形态,用CCK-8试剂分析细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,采用免疫荧光染色研究3-硝基酪氨酸(3-NT)蛋白表达的变化。结果表明:通过细胞形态学及表型鉴定,本实验培养的细胞均表达CD133、KDR抗体,vWF抗体表达阴性,可以认为这些贴壁细胞大部分都是EPCs;同时免疫荧光证明各实验组EPCs都表达同样的细胞表面标志,高糖的培养环境并未引起细胞分化。与正常对照组相比,应用含33mmol/L葡萄糖的EGM-2MV培养基处理EPCs48h后,高糖可以促进EPCs增殖,加入eNOS特异性抑制剂L-NAME处理后,其促进作用减弱;细胞周期分析显示高糖培养的EPCs大多处于增殖S期;高糖组EPCs的3-NT蛋白表达明显增加,加入L-NAME处理后,3-NT蛋白表达量较高糖组减少。通过以上研究,我们得出下列结论:(1)通过密度梯度法可成功从人脐血分离出血管内皮前体细胞。(2)高浓度葡萄糖培养EPCs可明显促进细胞增殖,但却不影响细胞分化。(3)高糖可使EPC表达3-NT蛋白增多,加入L-NAME后可明显逆转高糖对细胞的增殖作用。由此可见,高糖对EPCs的作用机制可能是通过引起细胞释放NO,从而促进细胞增殖;高糖不影响EPCs分化,即不影响血管形成作用,而只是促进了血管生成,从而生成糖尿病视网膜病变中的新生血管网。通过探究EPCs细胞增殖、分化的机制,研究血管发生和血管形成,可能为糖尿病视网膜血管病变的治疗提供新的方向。