线粒体转录终止因子蛋白家族是一类高度保守的线粒体DNA结合蛋白，广泛存在于后生动物与植物中，该家族共有四个成员，分别是线粒体转录终止因子1-4(MTERF1-F4)。已有研究表明，MTERF1-F3蛋白的功能都与线粒体基因组的复制和转录调控有关，但它们在体内与线粒体DNA的结合位点和作用方式却各不相同(Asin-Cayuela et al.，2004；Chen et al.，2005；Park et al.，2007；Wenz et al.，2009)。MTERF4蛋白与线粒体的核糖体RNA甲基转移酶NSUN4形成复合物，能直接控制线粒体核糖体的生物合成和翻译过程(Camara et al.，2011；Spahr et al.，2012)。　　 人线粒体转录终止因子2(hMTERF2、hMTERFL或hMTERFD3)基因最早由本实验室通过比较血清饥饿与血清培养细胞的基因表达谱差异发现(Chen etal.，2005)。通过生物信息学分析发现，hMTERF2基因定位于人12号染色体12q24.1，编码的蛋白由385个氨基酸组成，具有亮氨酸拉链(Leuzipper)结构，是一种典型的DNA结合蛋白。通过原核表达成功获得该基因的重组融合蛋白，纯化后经SDS-PAGE电泳分析表明其分子量大小约为44kDa。　　 已有研究发现，hMTERF2与人线粒体转录终止因子1(hMTERF1)有相同的DNA结合结构域，是一种线粒体类核蛋白(Pellegrini et al.，2009)。蛋白定位分析软件预测hMTERF2定位于人线粒体，其蛋白质N端1-35氨基酸为定位线粒体的前导肽序列。我们通过细胞免疫荧光对其进行亚细胞定位，结果进一步证实hMTERF2蛋白定位于人线粒体。国内外不同研究小组都发现hMTERF2能覆盖线粒体DNA全部区域，与线粒体DNA的结合没有序列特异性(Pellegrini et al.，2009；Huang et al.，2011；Hyvarinen et al.，2011)。hMTERF2对细胞增殖有强烈的抑制作用，然而它对细胞内线粒体氧化磷酸化活性的影响及调控细胞周期和细胞生长的具体机制并不十分清楚。　　 为研究hMTERF2在细胞内的功能，我们成功构建hMTERF2基因的真核表达载体hMTERF2-pFLAG和两个RNAi表达载体pSi-hMTERF2-1、pSi-hMTERF2-2。转染HeLa细胞后通过荧光定量PCR检测线粒体DNA拷贝量发现，过表达hMTERF2对线粒体DNA的复制起显著抑制作用(P<0.05)；半定量RT-PCR和Western blot检测发现hMTERF2的过强表达会降低线粒体编码基因的mRNA水平和线粒体编码蛋白水平，并且线粒体基因表达水平的下降幅度与DNA复制水平的下降幅度相近。我们推断过表达hMTERF2影响线粒体基因表达的机制有两种可能：一方面由于过表达hMTERF2对线粒体DNA的复制有强烈的抑制作用，其对线粒体基因转录及蛋白合成的影响可能是基于对整个线粒体DNA复制的抑制作用，线粒体DNA拷贝量的下降使转录后得到的线粒体mRNA减少、线粒体蛋白合成量减少。另一方面，过表达hMTERF2能够显著抑制线粒体转录起始过程。而RNAi下调表达hMTERF2则对线粒体DNA的复制无明显影响(P>0.05)。同样，下调表达hMTERF2使线粒体转录和翻译水平略有下降，但无显著差异。由于hMTERF2能与整个线粒体DNA结合，hMTERF2和hMTERF3均可对线粒体转录进行负调控，下调hMTERF2后对线粒体转录起始过程没有影响，暗示它的功能可能被同源的转录终止因子hMTERF3补偿。当与其它转录因子共同形成线粒体转录起始复合体时，hMTERF2蛋白可能并不是一个必需的转录因子。　　 进一步研究hMTERF2对线粒体氧化磷酸化活性的影响发现：过强表达hMTERF2使线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ酶活性明显下降，但对复合体Ⅱ的酶活性没有显著影响，可能由于复合体Ⅱ上没有线粒体基因编码的蛋白；过表达hMTERF2导致线粒体氧化磷酸化活性的下降，包括线粒体跨膜电位(MMP)和细胞ATP含量下降，线粒体的ROS水平上升。而RNAi下调hMTERF2表达后，线粒体跨膜电位(MMP)、细胞ATP含量以及线粒体ROS水平与对照转染组(mock)相比无显著差异，这与其对线粒体基因表达调控的结果一致。　　 研究还发现，血清饥饿能诱导hMTERF2蛋白表达，加入的血清生长因子能抑制hMTERF2蛋白表达。MTT检测和荧光显微计数结果显示，hMTERF2过强表达对细胞生长有抑制作用。流式细胞术分析表明，过表达hMTERF2蛋白导致G0/G1期细胞比例显著增加，S期和G2/M期细胞比例减少，细胞cyclin D1的表达水平和Rb基因磷酸化水平显著下降，这是由于过表达hMTERF2后细胞氧化磷酸化和ATP水平下降导致细胞出现G0/G1期阻滞；而hMTERF2表达被抑制时，细胞生长速度与对照未转染细胞相比无明显差异，细胞周期蛋白cyclinD1水平和Rb磷酸化水平与对照无显著差异。流式结果表明细胞周期能正常进行而未出现阻滞。细胞凋亡实验检测发现，过表达或抑制hMTERF2表达都不会引起细胞凋亡。　　 以上研究结果显示hMTERF2通过调节线粒体DNA基因表达和氧化磷酸化活性影响细胞周期，提示线粒体活性变化对细胞周期具有调控作用。因此，我们采用血清饥饿法同步化细胞，对血清刺激首个细胞周期进程中线粒体基因表达与氧化磷酸化活性的变化进行了研究，结果表明线粒体数量的增加，线粒体基因表达调控因子表达变化，线粒体基因表达变化以及氧化磷酸化和ATP水平的增加对血清刺激后细胞周期的正常进行非常重要。通过氧化磷酸化抑制剂寡霉素抑制细胞ATP合成，发现细胞ATP水平的下降导致细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1蛋白表达水平的下降，具有剂量依赖效应。细胞ATP水平下降导致细胞生长速度下降和细胞周期出现G0/G1或G2/M期阻滞，表明线粒体氧化磷酸化活性及细胞ATP水平介导了细胞周期调控。　　 本研究揭示了hMTERF2蛋白在细胞内通过氧化磷酸化活性调控细胞周期和细胞生长的机制，为进一步阐明线粒体转录终止因子蛋白家族的功能，探讨各家族成员之间的关系奠定基础，同时对揭示线粒体基因表达调控和氧化磷酸化活性与细胞周期、细胞生长的关系具有重要的意义。此外，本研究也试图从一个新的角度探讨细胞周期调控机制，这有助于扩展细胞周期调控研究思路。对线粒体基因表达和氧化磷酸化活性的干预将有可能成为某些细胞的细胞周期调控研究的新模型，也将为肿瘤等由于细胞增殖调控异常导致的疾病的诊断和治疗提供潜在的靶点。