研究背景心血管疾病（Cardiovascular diseae,CVD）导致我国城乡居民死亡率逐年升高,防治心血管疾病刻不容缓。流行病学研究表明绝经前女性其心肌梗死和心绞痛发病率低于同龄男性,而女性绝经后其心血管发病率逐渐升高,揭示雌激素（Estrogen,E2）水平降低与心血管疾病的发生密不可分。传统理论认为雌激素替代疗法（Estrogen replace therapy,ERT）可对绝经后女性心血管疾病发挥保护作用。尽管妇女健康倡议（Women’s health initiative,WHI）的早期研究结果否认ERT的心血管益处,但其后续分析发现,ERT可降低处于“机会窗”的绝经后妇女（年龄<60岁）动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发生率;且2012年丹麦的DOPS研究结果显示,妇女在绝经早期接受ERT,与对照组相比,其10年后总体死亡率、心力衰竭、心肌梗死等发生率明显降低。因此,进一步了解E2在心血管中的作用机制,发现更有效的分子靶点及其作用机制,为把ERT合理用于绝经后妇女延缓心血管疾病提供可靠的理论基础。E2发挥生物学效应分为基因效应和非基因效应。基因效应为E2进入胞质,与胞质受体结合后,进入细胞核与靶基因或受体反应元件结合,调控基因转录和翻译;而非基因效应其本质为细胞膜上的膜雌激素受体（membrane estrogen receptor,mER）与E2结合后,通过招募、激活胞内的一系列信号分子,产生快速非基因效应。近年来,雌激素的非基因效应逐渐成为研究热点,因为研究发现,在多个组织系统中,非基因效应均能对其功能产生重要的长期影响,例如E2的非基因效应可抑制血管损伤后新生内膜的形成,遏制骨质流失;且能避免E2的一些副作用,如不刺激小鼠子宫内膜形成,对乳腺癌裸鼠移植肿瘤的生长和转移无刺激作用。因此深入探究E2的非基因效应,可使E2在发挥有益作用的同时,避免其基因效应所引发的负面作用。H₂S是继NO、CO后的第三种气体信号分子,在机体内由胱硫醚合成酶（CBS）、胱硫醚裂解酶（CSE）、3-硫基丙酮酸硫基转移酶（3-MST）催化底物L-半胱氨酸（L-cys）产生。这种气体分子可自由穿过细胞膜,到达细胞内的作用靶点,从而影响下游信号通路。越来越多的实验表明H₂S参与体内免疫修饰、血管舒张、氧化应激衰减和血管生成等过程,同时研究显示内源性H₂S可减少血管内膜增殖、抑制黏附分子表达,进而保护血管组织免于AS损伤。我们的前期研究发现E2可刺激脐静脉内皮细胞（Umbilical vein endothelial cells,HUVECs）快速释放硫化氢（Hydrogen sulfide,H₂S）刺激动脉血管舒张。在血管内皮中,H₂S主要由CSE催化L-cys产生,E2是否通过影响CSE的活性调节H₂S的释放尚未清楚。而且,E2调节CSE活性的分子机制尚未阐明,内皮细胞释放H₂S对血管的整体效应尚不明确,H₂S能否通过影响体内动脉粥样硬化进程发挥血管保护作用还不明确。基于此,我们主要研究E2刺激内皮细胞释放H₂S的分子机制和此机制对血管的整体效应。研究目的探究E2通过非基因效应刺激血管内皮细胞释放H₂S的机制以及对血管功能的影响。方法及结果1 E2激活mER刺激HUVECs释放H₂S发挥非基因效应选择10 nM、1 nM、100 uM、10 uM、1 uM的E2处理HUVECs 15 min后,收集培养基上清液,利用硫敏感电极测出上清液硫离子水平代表内皮释放H₂S的水平,发现10 uM为最适处理浓度,10 uM的E2处理HUVECs 5、10、15、30、60 min,收集培养基上清液,利用硫敏感电极测出上清液硫离子水平代表内皮释放H₂S的水平,结果显示:与CON组相比,E2时间依赖性上调H₂S水平,其中15 min的效果最强（P<0.05,n=3）。转录抑制剂放线菌素D（ActD）和蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）通过抑制蛋白的转录与合成抑制基因效应的传导,ActD（10 uM）和CHX（200 uM）预处理HUVECs 30 min,再用E2（10 uM）处理15 min,结果表明:与CON组相比,单独E2处理组能增加H₂S的释放（P<0.001,n=3）,ActD（10 uM）和CHX（200 uM）预处理后加E2处理,与CON组相比,H₂S释放增加（P<0.001,n=3）。E2-BSA通过在E2上连接一个不能透过细胞膜的大分子BSA,从而阻断E2的基因效应,选择10 nM、1 nM、100 uM、10 uM、1 uM的E2-BSA处理HUVECs15 min后,收集培养基上清液,利用硫敏感电极测出上清液硫离子水平代表内皮释放H₂S的水平,发现10 uM为最适处理浓度。10 uM的E2处理HUVECs 5、10、15、30、60 min,收集培养基上清液,利用硫敏感电极测出上清液硫离子水平代表内皮释放H₂S的水平,结果显示E2时间依赖性上调H₂S水平,且在15min H₂S水平最高（P<0.05,n=3）。内皮细胞膜上存在三种类型的ER,分别为:mERα、mERβ、GPR30,为了解E2激活膜上哪种受体发挥非基因效应,GPR30激动剂G1（10^-66 M）单独处理HUVECs 5 min,ER抑制剂ICI（10^-77 M）、GPR30阻断剂G15（10^-66 M）预处理30 min后,E2（10 uM）15 min观察H₂S释放,结果表明:与CON组相比,单独E2处理组能增加H₂S的释放（P<0.001,n=3）,抑制ER后,E2促进H₂S释放的效应被抑制（P<0.001,n=3）,G15预处理HUVECs 30 min后再加E2刺激,与CON组相比,E2仍能增加H₂S的水平（P<0.01,n=3）。2 E2上调HUVECs中CSE蛋白磷酸化水平促进H₂S的释放E2处理HUVECs 5、10、15、30、60 min,免疫共沉淀检测CSE蛋白磷酸化水平,结果显示:与CON组相比,E2时间依赖性上调内皮细胞中CSE蛋白酪氨酸和丝-苏氨酸位点的磷酸化水平,且15 min酪氨酸和丝-苏氨酸上调的水平最高。3 E2激活PKGⅠβ上调CSE蛋白丝-苏氨酸的磷酸化水平我们的前期实验表明E2通过上调PKG的活性使H₂S释放增加,为了证明PKG参与E2释放H₂S这一信号传导通路,加入PKG抑制剂（KT5823,10 mM）预处理HUVECs 30 min,免疫共沉淀检测CSE蛋白磷酸化水平,自由基电极检测细胞上清液的H₂S水平。结果显示:与CON组相比,E2上调CSE蛋白酪氨酸、丝-苏氨酸位点的磷酸化水平,但是KT5823预处理后加入E2处理15 min,与单纯E2处理组相比,CSE酪氨酸、丝-苏氨酸磷酸化明显被抑制。与CON组相比,E2上调H₂S水平（P<0.05,n=3）,但是KT5823预处理后加入E2处理15 min,与单纯E2处理组相比,H₂S释放被抑制（P<0.05,n=3）。分别转染PKGⅠ-αsiRNA（20 nM）和PKGⅠ-βsiRNA（40 nM）预处理HUVECs24h后,再加入E2（10 uM）处理细胞15 min,E2处理HUVECs 15 min,结果表明:与CON组相比,E2上调H₂S的释放,转染PKGⅠ-αsiRNA后E2处理,与单纯E2处理组相比,CSE蛋白丝-苏氨酸磷酸化水平无明显变化,转染PKGⅠ-βsiRNA后E2处理15 min,与单纯E2处理组相比,CSE蛋白丝-苏氨酸磷酸化水平降低。分别转染PKGⅠ-α（2 ug）和PKGⅠ-β（2 ug）两种蛋白的过表达质粒预处理HUVECs 24h后,加入E2（10 uM）处理细胞15 min,结果表明:与CON组相比,E2上调H₂S的释放,转染PKGⅠ-αPlasmid后,CSE蛋白丝-苏氨酸磷酸化水平上升无统计学差异,PKGⅠ-βPlasmid转染后CSE蛋白丝-苏氨酸磷酸化水平升高。免疫共沉淀方法将CSE抗体作为IP抗体,Western blot检测CON组和E2（10uM）处理15 min组PKGⅠ-α和PKGⅠ-β蛋白的表达情况,结果显示:PKGⅠ-α和PKGⅠ-β都能与CSE发生交联,与CON组相比,E2处理组能增加PKGⅠ-β与CSE之间的交联,与此同时,与CON组相比,E2处理组减少PKGⅠ-α与CSE蛋白的交联。4 E2上调cGMP水平介导PKG/CSE通路上调H₂S的释放cGMP是PKG的上游信号分子,为了明确cGMP是否参与E2促H₂S释放这一进程,我们首先用ELISA法检测E2（10 uM）处理后HUVECs 5、10、15、30、60 min后的环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）的水平,结果显示E2可时间依赖性上调cGMP水平,其中15 min作用最强（P<0.001,n=3）。cGMP（10^-12^-1612^-16 M）分别处理HUVECs 15 min,Western blot测定细胞裂解液中p-VASP的表达水平;免疫共沉淀法将CSE作为IP抗体,Western blot测丝-苏氨酸表达水平;取加药后的细胞上清液作测H₂S水平,结果提示:与CON组相比,cGMP浓度依赖性上调PKG的活性,其中10^-1515 M的效果最强（P<0.001,n=3）,与CON组相比,cGMP在15 min浓度依赖性提升CSE蛋白丝-苏氨酸磷酸化水平,其中10^-1414 M的效果最强。与CON组相比,cGMP处理15 min浓度依赖性提升H₂S水平,其中10^-15M的效果最强（P<0.05,n=3）,我们选择10^-15M作为处理浓度。cGMP(10^-15M)分别处理HUVECs 5、10、15、30、60 min,Western blot测定细胞裂解液中p-VASP水平;免疫共沉淀法将CSE作为IP抗体,Western blot测丝-苏氨酸表达水平;取加药后的细胞上清液测H₂S水平。结果显示:与CON组相比,cGMP(10^-15M)时间依赖性提高PKG活性,其中10 min的作用最强（P<0.01,n=3）。与CON组比较,cGMP(10^-15M)能时间依赖性增加CSE蛋白丝-苏氨酸磷酸化水平,其中15 min作用最强。与CON组相比,cGMP(10^-15M)能时间依赖性提升H₂S释放的水平,10 min作用最强（P<0.01,n=3）。5 E2介导GC上调PKG的上游信号分子cGMP的水平细胞内cGMP由GC催化GTP产生,细胞内GC有两种类型:颗粒型鸟苷酸环化酶（particulate guanylate cyclase,pGC）和可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylyl cyclase,sGC）,为了解哪种GC参与E2促H₂S释放这一进程,分别加入sGC抑制剂（NS2028,10 nM）和激动剂（BAY41-2272,3 nM）预处理HUVECs30 min,E2（10 uM）处理细胞15 min,结果显示;与CON组相比,E2提升细胞中cGMP的水平（P<0.001,n=3）,NS2028预处理30 min后E2处理15 min,与E2单独处理组相比,cGMP水平降低有显著差异（P<0.05,n=3）。Western blot检测p-VASP的水平发现,与CON组相比,E2组增加p-VASP的表达（P<0.05,n=3）,sGC激动剂BAY41-2272组同样增加p-VASP的表达（P<0.05,n=3）,NS2028预处理30 min后E2处理15 min,与E2单独处理组相比,p-VASP的表达水平下降（P<0.05,n=3）。自由基电极检测细胞上清液中H₂S水平发现:与CON组相比,E2组H₂S水平提升（P<0.01,n=3）,NS2028预处理30 min后E2处理15 min,与E2单独处理组相比,H₂S水平下降（P<0.001,n=3）。sGC是NO的胞浆受体,分别加入NO供体（SNP,100 nM）、NO抑制剂（LNNA,1 mM）预处理HUVECs 1h后,再加入E2（10 uM）处理细胞15 min,结果显示:与CON组相比,E2单独处理组PKG活性增加有差异（P<0.05,n=3）,SNP处理组能增加p-VASP的表达（P<0.01,n=3）;LNNA预处理HUVECs 1h后E2处理15 min,与单独E2处理组相比,PKG活性无统计学差异（P>0.05,n=3）。转染颗粒型鸟苷酸环化酶（particulate guanylyl cyclase,pGC）siRNA（20 nM）预处理HUVECs 24h后,再加入E2（10 uM）处理15 min,结果显示:与CON组相比,E2增加H₂S水平（P<0.05,n=3）,pGC siRNA预处理E2处理15 min,与E2组相比,H₂S水平下降（P<0.01,n=3）。pGC-A的配体ANP（1 mM）处理HUVECs 5、10、15、30、60 min,Western blot测定细胞裂解液中p-VASP表达;将CSE作为IP抗体,Western blot检测磷酸化的丝-苏氨酸。结果显示:与CON组相比,ANP时间依赖性提升PKG活性。其中,15 min的效果最强（P<0.001,n=3）;与CON组相比,ANP时间依赖性促进CSE蛋白丝-苏氨酸磷酸化,15 min作用最为显著。6 ERα/Gαi-2/pGC-A介导E2促H₂S释放为了解内皮细胞中E2如何激活血管内皮细胞中的pGC-A发挥促H₂S释放效应,E2（10 uM）作用HUVECs 15 min后,将ER的两种亚型ERα和ERβ作为IP抗体,进行免疫共沉淀,Western blot检测pGC-A的表达水平。结果表明:pGC-A与ERα和ERβ都有交联,且与CON组相比,E2处理组ERα与pGC-A的交联增加,ERβ与pGC-A的交联减少。有文献报道,mER可与Gi蛋白的功能亚基Giα结合介导非基因效应的传导,为了解Gαi是否参与E2介导ERα/pGC-A途径增加H₂S释放这一过程,哪种Gαi亚型在这一过程占主导作用,E2（10 uM）作用HUVECs 15 min后,分别将Gαi1、2、3作为IP抗体,免疫共沉淀实验后,Western blot检测ERα、pGC-A的表达。结果显示:Gαi-1不能与ERα、pGC-A交联,Gαi-2、3能与ERα、pGC-A交联;与CON组相比,E2能增加Gαi-2、3与ERα、pGC-A之间的交联。为了确认哪种Gαi亚型发挥主要作用,分别向HUVECs转染Gαi-2、Gαi-3siRNA处理24h,E2（10 uM）作用HUVECs 15 min,Western blot检测细胞裂解液中p-VASP表达,取细胞上清液检测H₂S水平。结果显示:与CON组相比,E2组p-VASP表达水平上升（P<0.05,n=3）、H₂S水平增加（P<0.05,n=3）,预转染Gαi-2 siRNA 24h后E2处理15 min,与单纯E2组相比,PKG的活性被抑制（P<0.05,n=3）、H₂S的水平降低（P<0.01,n=3）。预转染Gαi-3 siRNA 24h,与单纯E2组相比,预转染Gαi-3 siRNA后E2处理15 min,与单纯E2组相比,PKG的活性无统计学差异（P>0.05,n=3）,但H₂S水平降低有差异（P<0.05,n=3）。7 E2通过非基因效应介导H₂S的释放内皮细胞转染雌激素受体突变体ERα（D258A）质粒,这种突变体质粒通过切断膜受体ERα和Giα的交联,从而阻断E2的非基因效应。转染ERα（D258A）突变质粒到HUVECs 48h后,E2（10uM）处理细胞15 min后,ERα作为IP抗体,Western blot检测Gαi蛋白的表达。取细胞裂解液Western blot检测p-VASP水平,收集细胞上清液检测H₂S水平。结果显示:与CON组相比,E2增加ERα和Giα的交联,p-VASP表达上调（P<0.05,n=3）,H₂S水平增加（P<0.05,n=3）;ERα（D258A）转染预处理细胞后E2处理15 min,与E2组相比,Gαi表达水平显著下降（P<0.01,n=3）,p-VASP表达水平下降（P<0.01,n=3）,H₂S释放减少（P<0.001,n=3）。8 E2刺激血管内皮释放H₂S对血管整体功能的影响为研究E2促H₂S释放对血管整体功能的影响,我们采用ApoE^–/–小鼠为模型,随机分组为OVX,OVX+E2,OVX+PPG+E2三组,取小鼠股动脉用血管张力测定系统检测血管张力,眼球取血用H₂S自由基电极检测血浆中H₂S水平。取小鼠心脏及主动脉进行冰冻切片,苏木素及油红O染色,用Leica Qwin软件定量计算主动脉瓣斑块面积。结果显示:与OVX组相比,OVX+E2组血管舒张增加有差异,与OVX+E2组相比,OVX+PPG+E2组减弱了由E2增加的Ach对血管的舒张效应（P<0.05,n=4）;与OVX组相比,OVX+E2组主动脉瓣斑块面积减少（P<0.05,n=7）,而H₂S的水平升高（P<0.05,n=7）;与OVX+E2组相比,OVX+PPG+E2组主动脉瓣斑块面积增加（P<0.05,n=7）,且H₂S水平下降（P<0.05,n=7）。结论1 E2通过与膜受体ERα结合,招募Giα作为中介信号,后者结合至鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase,GC）的胞内催化区域,发挥非基因效应。2 E2通过激活PKG导致下游靶蛋白发生广泛磷酸化。3 E2刺激HUVECs中CSE蛋白上丝苏-氨酸位点发生磷酸化,H₂S释放增加。