研究背景：结直肠癌是常见的恶性肿瘤,在男性中己位居所有肿瘤的第三位,女性中居第二位。2008年新增结肠癌病例有120万,死亡病例有608,700例。随着对结肠癌发生发展机制的认识不断深入,治疗方法的不断创新,经手术切除、化疗、放疗等积极治疗后,改善了患者的生活质量,但5年生存率仍无明显提高,结直肠癌术后仍可复发和转移,最终导致治疗失败甚至患者死亡。结直肠癌细胞的侵袭和转移若能被抑制,对肿瘤治疗将有很大促进。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)已被用于治疗急性早幼粒细胞性白血病,并且获得完全缓解的疗效。近年临床应用证实,ATRA可显著提高白血病患者5年生存率,降低复发。ATRA能否降低结直肠癌的远处转移?尚不清楚。　　ATRA为维生素 A的衍生物,是常用的诱导分化剂,可与细胞内维甲酸受体(retinoic acid receptor,RAR)和维甲酸类X受体(retinoic acid X receptor,RXR)结合。这些受体被激活后与靶基因中的维甲酸应答元件(retinoic acid response element,RARE)结合,以时间、剂量依赖的方式调节靶基因的表达,从而抑制增殖、诱导分化和凋亡。近年研究发现除应用于白血病的治疗外,体内外实验还证实 ATRA及其衍生物还可促进多种实体瘤细胞的分化,明显抑制肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌细胞的侵袭和转移,结果表明分化诱导对肿瘤细胞的侵袭、转移具有治疗和预防作用。但ATRA可产生较强的维甲酸综合症。为降低ATRA的毒副作用,本校药学院在ATRA的基础上合成了其衍生物:4-氨基-2-三氟甲基苯酯(4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate,ATPR),目前已证实ATPR可以抑制胃癌、肺癌和乳腺癌细胞的增殖和迁移。　　肿瘤的转移与其粘附性降低和运动性增强有关,肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表达增加和活化是非肌肉细胞运动的重要启动因素。ZO-1和occludin是最常见的紧密连接蛋白,其在细胞膜的定位决定了细胞间紧密连接状态。低分化的肿瘤细胞同质粘附能力降低,异质粘附能力增强,侵袭和迁移能力增强,因而具有高的转移潜能,而诱导分化后的癌细胞则反之,然后诱导分化是否能抑制肿瘤细胞的侵袭和转移?ATRA抑制肿瘤细胞的侵袭、转移,其作用机制是否通过降低细胞运动和增加细胞粘附性而发挥?尚不清楚。　　目前,ATRA及ATPR在结肠癌组织和细胞中的作用及其相关机制报道极少。本课题旨在探讨ATRA及ATPR对结肠癌RKO细胞生物学行为的影响,ATRA及其ATPR是否能降低结肠癌细胞的迁移及这种作用是否与MLCK和紧密连接蛋白的表达有关。为ATRA及ATPR更好的用于结肠癌的临床治疗奠定理论基础。　　目的：研究ATRA及ATPR对结肠癌细胞系RKO的增殖、凋亡、软琼脂克隆形成能力和迁移的影响,并初步探讨其可能的作用机制。　　方法：用不同浓度的ATRA和ATPR分别处理结肠癌细胞株RKO细胞,MTT和细胞周期检测试剂盒检测药物刺激后细胞的增殖能力;Real time PCR的方法检测ATRA和ATPR对RKO细胞增殖关键调控因子p21、cyclinD1 mRNA的水平。用Hoechst染色检测ATRA和ATPR对RKO细胞凋亡的影响;Soft agar检测RKO细胞软琼脂软琼脂克隆形成能力。细胞划痕实验检测两种药物对RKO细胞的迁移能力影响。为进一步研究ATRA和ATPR影响RKO细胞迁移的作用机制,real time PCR和免疫荧光法分析ATRA和ATPR对RKO细胞紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达和定位;Western blot检测 ZO-1、occludin、MLCK、MLC、MLCP、MAPK信号通路蛋白、凋亡和自噬相关蛋白、维甲酸受体和维甲酸X受体的表达。RKO细胞中分别和组合加入 ATRA,ATPR,PD98059,PMA和ML-7,采用细胞划痕实验观察细胞迁移变化。进一步验证ATRA与ATPR是通过何种机制影响MLCK等分子的表达和活性,构建ERK过表达和敲除的慢病毒载体,转染入RKO细胞中,检测ERK通路对MLCK表达的影响。构建MLCK敲除慢病毒载体并转染入RKO细胞,分别用流式细胞术、细胞划痕和soft agar检测MLCK敲除对RKO细胞增殖、迁移和软琼脂克隆形成能力的影响。　　结果：ATRA和ATPR均能抑制RKO细胞的增殖,使RKO细胞周期阻滞在G1/S期,这一作用与其上调p21和下调cyclinD1 mRNA水平有关。ATRA对RKO细胞的凋亡作用不明显,进一步分析显示 ATRA处理后 RKO细胞自噬标志性蛋白beclin-1和LC3β的表达均明显升高,抗凋亡蛋白的表达也提升。提示RKO细胞可能通过增加自噬而抵抗了ATRA诱导的凋亡作用。其衍生物ATPR在低浓度下即能有效诱导RKO细胞凋亡。Western结果显示ATPR对自噬相关蛋白的表达影响不大。ATRA和ATPR均能明显抑制RKO细胞迁移和软琼脂克隆形成能力,主要与降低细胞运动和增加细胞间紧密连接有关。结果证实 ATRA和ATPR抑制MLCK、MLC表达和MLC磷酸化,但是对MLCP表达没有影响,最终使MLC磷酸化降低,细胞运动能力降低。ATRA和ATPR上调occludin的表达并提高其在细胞膜的定位,对胞浆ZO-1的表达无明显影响,但是膜蛋白中可检测到两种药物处理后ZO-1的表达明显增加,免疫荧光的结果也证实ATRA和ATPR可增加occludin和ZO-1在细胞膜的定位。为了进一步明确ATRA和ATPR如何调控MLCK等分子的表达,我们检测了维甲酸受体的表达,结果发现结肠癌RKO细胞中RARγ和RXRβ的表达很低,但是RARα、RARβ、RXRα、RXRγ均有很强的表达。ATRA刺激RXRβ和RXRγ表达,ATPR对RARα、RARβ、RXRβ、RXRγ的表达有明显诱导作用。同时,在信号通路上,ATRA和ATPR可以抑制ERK/MAPK通路。我们加入了该通路的抑制剂和刺激剂,结果发现PD98059与ATRA或者ATPR联用可增加其抑制迁移的作用,相反PMA逆转了两种药物迁移抑制作用。为了明确ATRA和ATPR是否通过ERK通路下调MLCK的表达,构建了ERK过表达和敲除的慢病毒载体并转染入 RKO细胞,结果发现 ERK1的敲除明显抑制了 MLCK mRNA和蛋白的表达。进一步观察ATRA和ATPR是否通过降低MLCK来减少细胞的迁移,敲除RKO细胞中MLCK的内源性表达,结果发现RKO细胞的迁移和软琼脂克隆形成能力明显受到抑制。　　结论：ATPR具有与ATRA相同的抑制增殖、迁移和软琼脂克隆形成能力作用,但是ATPR对RKO细胞的凋亡诱导作用明显强于ATRA。ATRA及ATPR通过与维甲酸受体结合,下调cyclinD1和上调p21表达抑制RKO细胞的增殖;与相应受体结合后,ATRA和ATPR可抑制ERK/MAPK信号通路,下调MLCK的表达和活性,增加细胞间紧密连接蛋白的表达和定位,最终降低细胞运动性增加细胞间粘附而抑制RKO细胞迁移。